李 娜，楊 華，呂文濤，王興鑫，盧立志，肖英平*

（1.浙江農林大學動物科技學院，浙江杭州 311300；2.省部共建農產品質量安全危害因子與風險防控國家重點實驗室（籌），浙江杭州 310021；3.浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021）

番鴨作為一種重要的經濟動物，番鴨肉具有獨特的風味深受消費者喜愛，因此人們對鴨肉的需求也逐年增加。據中國畜牧業(yè)協會與世界糧農組織（FAO）數據統計，2019 年中國肉鴨年出欄約42.68 億只，約占全球肉鴨出欄量的68%[1]。其中番鴨在2019 年的出欄量為5.31 億只，占肉鴨總出欄量的16.2%[2]。

腸道是機體最大的消化系統，也是重要的黏膜屏障，在腸道免疫和穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[3]。完整的腸道屏障結構可以保證其功能的完善，這通常是通過腸絨毛長度和隱窩深度來體現[4]。腸道屏障包括物理屏障、消化吸收、免疫調節(jié)等多種生理功能，而緊密連接是腸屏障的組成部分，主要包括Claudin、ZO等[5-6]。緊密連接通常被認為是評價腸道通透性及完整性的重要指標[7-8]。通過對幼齡動物腸道菌群的早期干預會對其腸道黏膜形態(tài)和緊密連接蛋白表達起到積極的調控作用，如Yin 等[9]、Gong 等[10-11]、Li 等[12]都通過灌服盲腸內容物發(fā)酵液進行早期干預，發(fā)酵液中復合益生菌率先定殖于腸道中從而精準地發(fā)揮益生效果，被視為一種新的調節(jié)家禽生長和機體健康的策略。丁酸梭菌能夠調節(jié)機體腸道酸性環(huán)境，維持腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)、減輕炎癥反應，被做為飼料添加劑廣泛使用[12-15]。丁酸梭菌通過代謝產生丁酸來修復受損的腸屏障，并通過上調ZO-1和Claudin-1的表達來修復受損的腸上皮細胞[16]。雖然目前有大量關于丁酸梭菌在畜禽動物作用的研究報道，但主要集中于在飼料中添加使用[17-19]。目前是否可以在幼齡動物腸道微生物定植發(fā)育的窗口期階段，通過益生菌早期干預來定向改變微生物的發(fā)育演替，從而改善動物的生產性能目前并不清楚。本研究以典型的飼用益生菌——丁酸梭菌為研究對象，選擇番鴨為研究模型，通過丁酸梭菌早期灌服探討其早期干預對幼齡番鴨體重、腸道黏膜形態(tài)及腸道緊密連接蛋白表達的影響，以期丁酸梭菌等益生菌的應用和番鴨養(yǎng)殖提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計 在蘭溪禾旺禽業(yè)專業(yè)合作社選用160 只1日齡、體重（47.3±3.9）g 的初出殼番鴨，隨機分為2 組，每組8 個重復，每個重復10 只。丁酸梭菌組于剛出殼2 h內每只灌服1 mL 丁酸梭菌菌液（≥2×109CFU/mL），連續(xù)灌服3 d；對照組每只灌服1 mL 生理鹽水。日糧組成和營養(yǎng)成分見表1。自由采食飲水。飼養(yǎng)周期為2 周。

丁酸梭菌菌液制備：菌株購于日本米雅利桑制藥株式會社生產企業(yè)生產的酪酸桿菌活菌片；取20 mg 丁酸梭菌于用50 mL MRS 肉湯中，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，制備成活菌數≥2×109CFU/mL 的菌液。

表1 日糧組成及營養(yǎng)成分

1.2 飼養(yǎng)管理 番鴨飼養(yǎng)于浙江省農業(yè)科學院實驗動物房內。提前1 周對實驗動物房及其他飼養(yǎng)設備進行徹底打掃和消毒。試驗期間人工投喂，自由采食和飲水。第1 周溫度控制在32℃左右，第2 周溫度控制在30℃左右。

1.3 生長性能測定 于第7、10、14 日齡當天早晨空腹稱重，并記錄采食量，計算平均日采食量和耗料增重比，參照標準《家禽生產性能名稱術語和度量統計方法》（NY/T 823-2004）進行生長性能測定，計算公式：

1.4 樣品采集及腸道黏膜形態(tài)測定

1.4.1 樣品采集 在第7、10、14 日齡進行采樣，每個重復隨機挑選1 只番鴨進行屠宰，解剖后迅速分離腸道，剪取1 cm 左右回腸組織（回腸中段）于4% 多聚甲醛中固定，用于制備切片；另取回腸及盲腸腸段立即冷凍至液氮，隨后轉移到-80℃冰箱保存。

1.4.2 腸道黏膜形態(tài)測定 取樣修整，脫水，包埋，切片，染色，每個樣本切片做3 個重復。應用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA） 軟件以200 倍標尺（200 μm）為標準進行拍照分析絨毛高度（VH）和隱窩深度（CD）。并計算絨毛高度與隱窩深度的比值（VH/VD）。

1.5 腸道緊密連接蛋白表達量分析

1.5.1 總RNA 提取及cDNA 的合成 采用TRIzol?Plus RNA Purification Kit（Thermo Fisher）和SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Thermo Fisher）對回腸和盲腸組織分別進行總RNA 提取以及第一鏈cDNA 合成，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.5.2 RT-PCR 選取GAPDH為內參基因，采用Primer Premier 6.0 軟件設計引物，由生工生物工程股份有限公司（上海）負責合成（表2）。反應條件：95℃預變性1 min；95℃變性10 s，60℃退火延伸25 s，進行40 個循環(huán)。每個樣本設置3 個復孔，采用2-ΔΔCt法基因相對表達量。

1.6 統計分析 用SPSS 19 軟件進行T 檢驗，結果以平均值± 標準差表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，并用GraphPad Prim6 進行作圖分析。

2 結果

2.1 丁酸梭菌早期干預對幼齡番鴨生長性能的影響 由表3 和表4 可知，與對照組相比，丁酸梭菌早期干預后番鴨體重在7、10 和14 日齡略有升高（P＞0.05）；平均日采食量、耗料增重比在1～7、8～10、11～14 日齡均降低（P＞0.05）。

表2 RT-PCR 引物序列與參數

表3 丁酸梭菌早期干預對番鴨體重的影響 g

表4 丁酸梭菌早期干預對番鴨平均日采食量和耗料增重比的影響

2.2 丁酸梭菌早期干預對對番鴨腸道黏膜形態(tài)結構的影響 由圖1 可以看出，對照組在第7 日齡腸道絨毛頂端上皮脫落較為嚴重且絨毛密度較低，而第10 和14 日齡丁酸梭菌組比對照組絨毛更密集，絨毛高度相對較高，并且完整性也更好。由表5 可知，在第7 日齡丁酸梭菌組VH 和VH/CD 較對照組均顯著增加，而CD 顯著降低；第10 日齡丁酸梭菌組VH 以及VH/CD 顯著增加，CD 無顯著性影響；第14 日齡兩組VH、CD 以及VH/CD 均無顯著性差異。

2.3 丁酸梭菌早期干預對對番鴨回腸緊密連接蛋白表達的影響回腸 如圖2 所示，與對照組相比，在第7 日齡，丁酸梭菌組Claudin1基因相對表達水平上調了111%（P=0.011）、Claudin2 表達上 調111%（P=0.000）、ZO-1表達上調132%（P=0.011）、ZO-2表達上調143%（P=0.002）。在第10 日齡，丁酸梭菌組Claudin1基因相對表達水平上調了111%（P=0.02）、Claudin2表達上調243%（P=0.024）、ZO-2表達上調108%（P=0.027）。而4 種基因相對表達水平在第14 日齡時均無顯著性差異。

圖1 回腸黏膜切片分析

2.4 丁酸梭菌早期干預對對番鴨盲腸緊密蛋白表達的影響 如圖3 所示，與對照組相比，在第7 日齡，丁酸梭菌組Claudin2基因相對表達水平下調65%（P=0.010）；Claudin1、ZO-1和ZO-2相對表達水平均無顯著性差異。在第10 日齡，丁酸梭菌組Claudin2基因相對表達水平上調46%（P=0.009）；Claudin1、ZO-1和ZO-2相對表達水平無顯著性差異。在第14 日齡，丁酸梭菌組Claudin2基因相對表達水平上調131%（P=0.018）；Claudin1下調51%（P=0.106）、ZO-1和ZO-2相對表達水平無顯著性差異。丁酸梭菌組Claudin1、ZO-1和ZO-2相對表達水平在第7、10 和14 日齡差異均不顯著。

3 討 論

已有大量研究表明，丁酸梭菌能夠促進畜禽的生長性能，有助于機體健康。丁酸梭菌能夠提高肉雞的生長性能、顯著影響斷奶仔豬的平均日增重、顯著增加北京鴨體重[17-19]。本研究中，早期灌服丁酸梭菌后，番鴨體重有上升趨勢，且能夠在一定程度上降低番鴨的平均日采食量及耗料增重比，表明丁酸梭菌早期干預對番鴨生長性能有著積極作用。

小腸是動物機體消化吸收的主要部位，完整的腸道結構對動物的消化吸收具有重要意義，這與小腸VH 和CD 的形態(tài)特征密切相關[20-21]。同時動物機體健康在很大程度上依賴于復雜的腸道系統，包括腸道形態(tài)及腸屏障功能的完整性[4]。其中VH 對營養(yǎng)物質的吸收發(fā)揮著重要作用，CD 代表了上皮細胞的成熟狀態(tài)，而VH/CD越大表明小腸的吸收能力越好[22]。已有研究表明，小腸VH 升高有助于對營養(yǎng)物質的運輸和吸收[23]，丁酸梭菌能夠顯著影響小腸VH 以及VH/CD[24-25]，這與本研究的結果一致，第7 日齡丁酸梭菌組回腸的VH、VH/CD 均顯著升高，CD 顯著降低；第10 日齡回腸VH 也顯著升高。主要原因可能是丁酸梭菌產生的丁酸能夠提供營養(yǎng)物質來修復和再生腸道上皮細胞[26]。由此可見，早期灌服丁酸梭菌有助于番鴨小腸形態(tài)的發(fā)育并改善腸道黏膜結構，特別是VH；從而有助于提高番鴨腸道對營養(yǎng)物質的代謝和消化吸收，促進機體的生長發(fā)育。

表5 丁酸梭菌早期干預對腸道黏膜形態(tài)的影響

圖2 丁酸梭菌早期干預對番鴨回腸緊密連接蛋白表達的影響

圖3 丁酸梭菌早期干預對番鴨盲腸緊密連接蛋白表達的影響

腸道屏障作為維護腸道不受外界致病因子侵害的第一道防線，對保護機體健康有著重要意義[27]。Claudin和ZO是緊密連接的主要組成部分，參與維持細胞極性、結構完整性、黏附作用以及緊密連接屏障的功能[15,28]。本研究采用qRT-PCR 技術來闡明早期灌服丁酸梭菌對番鴨回腸和盲腸中緊密連接蛋白基因(Claudin1、Claudin2、ZO-1和ZO-2) 的相對表達水平的影響，結果表明，早期灌服丁酸梭菌能夠在第7 日齡和第10 日齡顯著上調回腸中4 種緊密連接蛋白基因的表達，以及在第14 日齡有上調趨勢。已有研究結果也表明，丁酸梭菌在腸道中產生丁酸，可為腸上皮細胞提供能量，能夠顯著提高Claudin和ZO的表達，并在腸道屏障的形成和調節(jié)中起重要作用[26,29]。而在盲腸中，與對照組相比，丁酸梭菌組Claudin1、ZO-1和ZO-2相對表達水平在第7、10 和14 日齡差異均不顯著；Claudin2相對表達水平在第7 日齡顯著降低，第10 日齡極顯著升高，在第14 日齡時顯著升高，這可能是在7 日齡階段盲腸微生物仍然處于動態(tài)演替的發(fā)育性變化中，丁酸梭菌干預使得菌群結構發(fā)生變化，影響宿主的基因表達[30-31]，從而短時期內影響了Claudin2表達，由此說明丁酸梭菌早期干預主要是提高回腸緊密連接蛋白基因的表達，具體原因有待進一步研究。

4 結 論

通過對剛出殼（1 日齡）番鴨進行連續(xù)3 d 丁酸梭菌（2×109CFU/mL）早期干預能夠顯著提高7～10 日齡番鴨回腸VH，降低CD 以及VH/CD，還能提高回腸緊密連接蛋白Claudin1、Claudin2、ZO-1和ZO-2的相對表達水平，改善腸道形態(tài)及屏障功能，從而對動物機體健康、生長發(fā)育和生長性能有一定促進作用。