丁靜，呂海芹，王鶴飛，張晗，陳文文，黨和勤，劉燕琳

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，山東 泰安 271000；2.山東省煤炭泰山療養(yǎng)院藥劑科，山東 泰安 271000)

桑黃(Phellinusigniarius)為多孔菌科，火木層孔菌的子實體。桑黃是食藥兩用真菌，作為中藥使用始于唐代《藥性論》味微苦、性寒，主要用于活血、止血、化飲、止瀉。長期研究表明桑黃具有抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化等作用[1-3]。近期，有研究表明桑黃具有治療小鼠血吸蟲病肝纖維化的作用[4]。桑黃可通過抑制核因子-κB(NF-κB)的核轉(zhuǎn)移，降低腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的分泌量，進而減低炎癥反應(yīng)[5]。然而桑黃成分復(fù)雜、相關(guān)靶點研究較少，使得深入研究面臨很大困難，對肝臟疾病作用的活性成分及靶點尚未有明確研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)運用計算機模擬、多個數(shù)據(jù)庫檢索分析，通過多學(xué)科融合研究中藥活性成分在人體的作用靶點，系統(tǒng)闡述藥物作用機制，構(gòu)建藥物與疾病之間相互作用靶點的網(wǎng)絡(luò)，為研究成分復(fù)雜、分子機制模糊、作用靶點較多的中草藥提供新的研究思路。本文結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過整合桑黃多種成分、多個靶點、多種基因，系統(tǒng)地分析了桑黃對肝臟炎癥疾病的分子作用機制，為今后深入研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Phaimacology Database and Analysis Platform)；Uniprot數(shù)據(jù)庫；GendCards數(shù)據(jù)庫；String數(shù)據(jù)庫；DAVID數(shù)據(jù)庫；ClueGo軟件；Cytoscape 3.7.2軟件。

1.2 篩選桑黃的化學(xué)成分 本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)中使用CancerHSP軟件檢索桑黃的所有化學(xué)成分。含有相關(guān)的化學(xué)成分共9種。對所有化學(xué)成分進行篩選，化合物口服生物利用度OB≥20%，共有3個化合物通過篩選，進行下一步研究。

1.3 桑黃活性成分作用靶點及肝炎疾病靶點的篩選 采用CancerHSP軟件對候選化合物進行檢索，得到它們對應(yīng)的靶點，通過Uniprot(https：//www.uniprot.org)將靶點選為人源(human)，刪除重復(fù)靶點后得到標(biāo)準(zhǔn)化基因名。

檢索GendCards數(shù)據(jù)庫，獲得肝炎(hepatitis)的疾病靶點。將桑黃的活性成分作用靶點與肝炎疾病靶點進行比對，找出關(guān)鍵靶點進行后續(xù)分析。

1.4 構(gòu)建桑黃化學(xué)成分-肝炎-靶點網(wǎng)絡(luò)圖 將篩選出的桑黃-肝炎有關(guān)的作用靶點基因通過Excel建立對照關(guān)系，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，建立化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。網(wǎng)絡(luò)圖中紅色節(jié)點表示疾病，黃色節(jié)點表示化合物，紫色節(jié)點表示靶點基因，相互關(guān)系以“邊”表示。與疾病相連接的靶點即為桑黃-肝炎關(guān)鍵作用靶點，與化合物相連的邊越多說明化合物作用靶點越多。

1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI) 將桑黃-肝炎關(guān)鍵靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(“Homo sapiens”種屬)，得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)出相關(guān)數(shù)據(jù)，使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過多節(jié)點之間相互作用關(guān)系分析蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系。PPI圖中以“度”表示與節(jié)點有相互作用的節(jié)點數(shù)目，“度”值越大表明該節(jié)點參與生物作用越多。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路分析 通過ClueGo軟件對桑黃-肝炎作用靶點基因進行GO(gene ontology)生物學(xué)過程富集和KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析。GO分析是選擇生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組成(CC)和分子功能(MF)3個功能，閾值P<0.05進行分析。使用R語言對KEGG通路富集分析結(jié)果進行整理，P<0.05，列出桑黃活性成分與肝炎相關(guān)的關(guān)鍵通路。

2 結(jié)果

2.1 桑黃的活性成分及作用靶點 通過Lab of Systems Pharmacology網(wǎng)站中的CancerHSP數(shù)據(jù)庫檢索得到桑黃中化學(xué)成分有9種(見表1)。以口服生物利用度OB≥20%為條件對化合物進行篩選，選擇其中的(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one、Phelligridin A及Phelligridin E(結(jié)構(gòu)式見圖1)3種作為桑黃的有效成分進行分析。

表1 桑黃中的9種化學(xué)成分詳細(xì)信息

2.2 桑黃-肝炎作用靶點預(yù)測 選中的3個活性成分通過CancerHSP數(shù)據(jù)庫檢索得到各自對應(yīng)的作用靶點，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫找出靶點對應(yīng)的人源標(biāo)準(zhǔn)化基因，整合去重后共得到標(biāo)準(zhǔn)靶點基因30個。

由GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索獲得肝炎的疾病靶點共11 584種，將桑黃作用靶點基因與肝炎靶點基因取交集，共得到22個基因作為桑黃-肝炎預(yù)測作用靶點進行后續(xù)分析(見圖2)。

2.3 桑黃有效成分-肝炎-靶點網(wǎng)絡(luò)圖 將桑黃活性成分與肝炎對應(yīng)的作用靶點基因進行整理，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2作圖，得到化合物-疾病-靶點基因網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。3個黃色中心節(jié)點為化合物節(jié)點，與中心點相連接的是各化合物對應(yīng)的靶點基因(以紫色表示)。與肝炎節(jié)點(紅色)連接的靶點基因即為桑黃-肝炎關(guān)鍵基因。由圖3可以看出桑黃各化學(xué)成分與關(guān)鍵靶點之間的相互作用關(guān)系，3種化合物拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析見表2，其中(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one和 Phelligridin E對應(yīng)的作用靶點相對較多，說明兩者在桑黃臨床療效上具有重要作用。

圖1 桑黃有效成分結(jié)構(gòu)式

圖2 桑黃-肝炎靶點基因交集圖

圖3 化合物-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 桑黃-肝炎蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)分析 為更好地研究桑黃-肝炎作用機制，本研究采用String數(shù)據(jù)庫，物種選擇為“Homo sapiens”，導(dǎo)入22個關(guān)鍵靶點得到蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，將得到的結(jié)果去除一個無關(guān)聯(lián)基因后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2作圖(見圖4)。圖中每個節(jié)點代表一種靶點蛋白，節(jié)點之間連線代表兩種蛋白之間有相互作用，節(jié)點顏色越近紅色表明相互作用蛋白越多，節(jié)點顏色由紅色-黃色-綠色逐漸過渡，相互作用節(jié)點逐漸減少。

圖4 桑黃蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

表2 化合物拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析表

使用Network Analyzer對網(wǎng)絡(luò)圖進行拓?fù)浞治?見表3)，度(Degree)表示與該節(jié)點相互作用節(jié)點的數(shù)目，度值越大表明該節(jié)點參與的生物功能越多；接近中心性(betweenness centrality)和緊密度中心性(closeness centrality)是節(jié)點在整個網(wǎng)絡(luò)中所載的中心程度。中央有6個節(jié)點的度>5，依次為：單胺氧化酶B(MAOB)、黃嘌呤脫氫酶(XDH)、乙醛脫氫酶2(ALDH2)、SMAD蛋白3(SMAD3)、乙醛脫氫酶3A1(ALDH3A1)、細(xì)胞色素P450 2A6亞型(CYP2A6)，提示這些靶點在桑黃治療肝炎的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

2.5 GO生物過程與KEGG通路富集分析 GO生物過程富集分析主要包括生物過程分析(bioligical process,BP)、分子功能分析(molecular function,MF)和細(xì)胞組成分析(cellular component，CC)，以闡述基因的生物學(xué)過程。本文采用ClueGO分析軟件對桑黃-肝炎的22個關(guān)鍵基因進行富集分析(P<0.05),得到GO分析結(jié)果如表4。從表中看出，在生物過程(BP)中，靶點主要涉及正向調(diào)節(jié)乙醛脫氫酶[NAD(P)+]、作用于NAD或NADP醛基或氧橋基調(diào)節(jié)氧化還原酶活性正向調(diào)控兩個生物過程。

表3 蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)靶點及其拓?fù)鋮?shù)

表4 關(guān)鍵靶點的生物過程富集分析

KEGG通路富集結(jié)果以相關(guān)基因比例為橫坐標(biāo)，基因名稱為縱坐標(biāo)，相關(guān)基因數(shù)量以點大小表示，P值以顏色表示得到四維圖(見圖5)。桑黃治療肝炎涉及糖異生/糖酵解(glycolysis/gluconeogenesis)、組氨酸代謝(histidine metabolism)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、藥物代謝(drug metabolism)等相關(guān)信號通路，各通路涉及基因由表5可見。

圖5 桑黃治療肝炎關(guān)鍵靶點KEGG信號通路富集結(jié)果

表5 KEGG信號通路相關(guān)靶基因

3 討論

桑黃是泰山地區(qū)道地藥材，為食藥兼用真菌，明清泰山古籍曾記載具“驅(qū)邪滋補，扶正固本”之功效。桑黃味微苦，能利五臟、軟堅、排毒。桑黃化學(xué)成分研究報道較少，尤其對人體肝臟疾病作用的活性成分及靶點尚未有明確研究。為了理清桑黃的有效成分、作用靶點、分子作用機制，我們選擇了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進行初步探索研究。

關(guān)于桑黃藥理作用的研究較少，在常用的TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找不到桑黃相關(guān)信息，僅能在CancerHSP軟件中檢索到9中桑黃化學(xué)成分。其中以(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl) but-3-en-2-one的口服吸收度(OB=32.39%)最好。經(jīng)檢索，該化合物作用于多個靶點其中包括乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)，單胺氧化酶B(monoamine oxidase Type B,MAO-B)等。本研究通過對藥物化學(xué)成分和疾病靶點相互作用進行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，GO分析及KEGG分析，我們最終發(fā)現(xiàn)桑黃對肝炎作用的核心靶點在ALDH2、ALDH3A1、ALDH3B1、MAOB，對應(yīng)的有效成分均為(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one。此成分主要通過乙醛脫氫酶(ALDH)發(fā)揮治療肝炎的作用。有大量研究表明乙醛脫氫酶(ALDH)與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。ALDH家族中共有19種功能基因，是人類肝臟中氧化乙醛的關(guān)鍵酶，對肝臟起重要的保護作用。其中以ALDH2活性最高，ALDH2主要位于肝臟中，在心臟、腎臟、肌肉、腦組織中也有表達(dá)。在Stachowicz等[7]研究中發(fā)現(xiàn)ALDH2的活化可以減輕非酒精脂肪性肝炎(NASH)的發(fā)展，通過激活A(yù)LDH2增加其氧化乙醛的活性可以減少非酒精性脂肪肝、酒精引起的肝細(xì)胞壞死。有研究表明ALDH2基因缺失時可以導(dǎo)致酒精攝入人體后出現(xiàn)乙醛和糖皮質(zhì)激素水平增高，抑制血清中細(xì)胞因子釋放，可抑制T細(xì)胞的活化，減輕肝臟炎癥[8]。

在KEGG通路富集分析中我們得到的結(jié)論是桑黃治療肝炎的關(guān)鍵靶點包括組氨酸代謝(histidine metabolism)、酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)、苯丙氨酸代謝(phenylalanine metabolism)、色氨酸代謝(tryptophan metabolism)、丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、藥物代謝(drug metabolism)等相關(guān)信號通路。組氨酸可減輕高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠肝損傷，對肝臟細(xì)胞有一定的保護作用[9]。有研究表明絡(luò)氨酸代謝異常可引起肝纖維化，F(xiàn)AH(fumarylacetoacetate hydrolase)基因剔除大鼠(簡稱Fah-/-大鼠)因為酪氨酸代謝障礙產(chǎn)生肝纖維化，廣泛用作肝纖維化模型[10]。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索了桑黃主要活性成分、對肝炎作用靶點、相關(guān)生物信號通路。結(jié)果表明桑黃中(E)-4-(3,4-Dihydroxyphenyl)but-3-en-2-one是治療肝炎的有效成分，其作用機制與乙醛脫氫酶(ALDH)相關(guān)，通過多個通路發(fā)生作用。為進一步深入研究桑黃作為食藥兩用真菌作用機制提供依據(jù)。