安依凡 韓猛 姚峰

摘要 從山西運城鹽湖泥中采樣獲得了貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5，為了確定其固體發(fā)酵產(chǎn)出的次代菌株是否有效拮抗煙草赤星病菌，進(jìn)行了貝萊斯芽孢桿菌菌株RJW-5-5的固體發(fā)酵，接著使用其次代菌株JW-5-AN和煙草赤星病菌進(jìn)行平板對峙試驗，并建立了一種平板對峙試驗描述方法，提出了幾個平板對峙試驗描述術(shù)語，再結(jié)合顯微檢測，結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN拮抗煙草赤星病菌，其進(jìn)攻型拮抗速率為5.56 mm/d，防御型拮抗指數(shù)為0.576 0，固體發(fā)酵次代菌株JW-5-AN的平板檢測結(jié)果為5×108CFU/g。這表明貝萊斯芽孢桿菌菌株RJW-5-5具有研發(fā)防治煙草赤星病菌微生物菌劑的潛力。

關(guān)鍵詞 貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5;煙草赤星病菌;次代菌株JW-5-AN;進(jìn)攻型拮抗速率;防御型拮抗指數(shù);微生物菌劑

Abstract To determine Bacillus velezensis RJW-5-5s antagonistic ability against tobacco brown spot disease （TBSD） in an elementary level， we processed a lab-level solid fermentation with an outcome of Bacillus strain JW-5-AN， secondary generation of RJW-5-5.The research then conducted an antagonistic experiment with TBSD and Bacillus strain JW-5-AN in a confrontation plate.The research also proposed an alternative way to assess the antagonistic ability of strain JW-5-AN with the conjunction of two timing samples of the confrontation plate experiment by defining some terms as 1-dimensional antagonistic ability， offensive antagonistic velocity， defensive antagonistic quota and 2-dimensional antagonistic ability.The results showed that the antagonistic rate of the offensive strain JW-5-AN was 5.56 mm/d， and the antagonistic index of the defensive strain was 0.576 0. The results of the plate test of the second-generation strain JW-5-AN by solid fermentation was 5×108 CFU/g.Combined with microscopic observation and plate detection， the research concluded that Bacillus velezensis strain RJW-5-5 antagonizes TBSD and the strain had a potential for microbial agent.

Key words Bacillus velezensis RJW-5-5;Tobacco brown spot disease;Secondary strain JW-5-AN;Offensive antagonistic velocity;Defensive antagonistic quota;Microbial agent

煙草赤星?。╰obacco brown spot disease）是烤煙生長過程中多發(fā)的一種病害?？緹熞坏┗忌铣嘈遣?，葉片上就會出現(xiàn)很多病斑，影響烤煙進(jìn)行正常的光合作用，阻礙烤煙的健康生長[1]。隨著化學(xué)農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染問題的日趨嚴(yán)重，在煙草病害防治過程中應(yīng)減少化學(xué)農(nóng)藥的使用。芽孢桿菌是一類產(chǎn)芽孢、革蘭氏染色呈陽性的細(xì)菌類群，具有較好的生物防治煙草病害的潛力，已成為研發(fā)生物防治菌劑的理想對象[2]。筆者研究新發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌菌株RJW-5-5能否拮抗煙草赤星病菌，以及新發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌菌株RJW-5-5是否具有研發(fā)防治煙草赤星病微生物菌劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5。2018年12月，從山西運城鹽湖泥中采得土壤樣本。經(jīng)過分離和篩選，一株功能特別、生長力旺盛的菌株RJW-5-5被發(fā)現(xiàn)，菌株RJW-5-5的細(xì)胞電鏡照片見圖1。將菌株RJW-5-5交由中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心進(jìn)行鑒定，利用微生物脂肪酸快速鑒定系統(tǒng)（MIDI）進(jìn)行脂肪酸組成檢測，利用Biolog GENⅢ進(jìn)行生理生化檢測，其主要細(xì)胞脂肪酸特征和生化代謝特征符合芽孢桿菌（Bacillus）屬特征，隨后又對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，綜合鑒定結(jié)果顯示菌株RJW-5-5為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

1.1.2 次代菌株JW-5-AN。

2005年，Ruiz-García等[3]從西班牙南部馬拉加貝萊斯河采集的苦咸水樣品中首次分離得到貝萊斯芽孢桿菌，貝萊斯芽孢桿菌能產(chǎn)生具有廣譜抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物[4-6]。

為了確定經(jīng)典固體發(fā)酵法能否培育穩(wěn)定的RJW-5-5次代菌株，進(jìn)行了菌株RJW-5-5的固體發(fā)酵培養(yǎng)，獲得其次代菌株JW-5-AN，圖2為菌株JW-5-AN的菌落形態(tài)。

1.1.3 儀器、工具和培養(yǎng)基。

儀器：立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠;單人垂直送風(fēng)超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司;振蕩培養(yǎng)箱SPX-250B-D型，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;小寶多功能粉碎機XY-600B，永康市小寶電器有限公司;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;調(diào)速多用振蕩器HY-4，國華電器有限公司;OLYMPUS CX31光學(xué)顯微鏡等。

工具：玻璃錐形瓶、培養(yǎng)皿、涂布棒、小量筒、試管、打孔器、接種環(huán)、離心管、移液槍等。

LB固體培養(yǎng)基：酵母5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂15～20 g、無菌水1 000 mL。PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、無菌水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株選擇。

選擇貝萊斯芽孢桿菌菌株RJW-5-5的次代菌株JW-5-AN與煙草赤星病菌進(jìn)行平板對峙試驗，以確定貝萊斯芽孢桿菌菌株JW-5-AN是否拮抗煙草赤星病菌，是否具有研發(fā)防治煙草赤星病微生物菌劑的潛力。這些菌株的選擇承接了西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒和資源微生物實驗室科研團(tuán)隊數(shù)以年計的辛勤勞動[7-10]。

1.2.2 次代菌株JW-5-AN的固體發(fā)酵與平板檢測。

1.2.2.1 菌株活化及液體培養(yǎng)基菌懸液制備。

取保藏于斜面的菌株試管1支，在無菌操作條件下，用接種針挑取斜面菌株，劃線法轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿內(nèi)，轉(zhuǎn)接2個培養(yǎng)皿，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌株活化。制作LB液體培養(yǎng)基500 mL，5 g胰蛋白胨，5 g NaCl，2.5 g酵母浸粉，加入500 mL無菌水中充分溶解，分裝至5個錐形瓶中，每個錐形瓶裝100 mL。將制作好的液體培養(yǎng)基置于滅菌鍋中120 ℃滅菌30 min。在無菌操作條件下，取出活化的菌株培養(yǎng)皿，用接種環(huán)挑取適量菌株，將菌株置入錐形瓶LB液體培養(yǎng)基中，重復(fù)操作5次，制作5瓶液體培養(yǎng)基種子液。將種子液置于轉(zhuǎn)速180 r/min搖床中培養(yǎng)48 h，即為制備的液體培養(yǎng)基菌懸液。

1.2.2.2 固體發(fā)酵培養(yǎng)基的接種和發(fā)酵。

將攪拌放置好的固體培養(yǎng)基分裝入錐形瓶，200 g一瓶，裝13瓶，封口后置于滅菌鍋中120 ℃滅菌30 min。將培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)基菌懸液和滅菌后的固體培養(yǎng)基置于無菌操作條件下進(jìn)行接種，按液體和固體1∶10（V/M）比例接種。接種完畢后攪拌，將錐形瓶封口放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵120 h。

1.2.2.3 固體發(fā)酵產(chǎn)物的烘干、粉碎與過篩。

取出錐形瓶，如已發(fā)酵好，可以看到培養(yǎng)基上長滿白色的菌絲，取出發(fā)酵好的固體培養(yǎng)基，倒入2個鐵瓷盤中，使其分散平鋪。然后放入烘箱中烘干，設(shè)置烘箱溫度50 ℃，烘干48 h。取出烘干的固體發(fā)酵物，用粉碎機粉碎，再用毛刷將粉碎后的固體發(fā)酵物倒入80目篩子過篩，將過濾好的粉末裝入自封袋中，寫好標(biāo)簽。

1.2.2.4 平板檢測。

取貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN固體發(fā)酵粉，稱量1 g后置于培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺內(nèi)，向培養(yǎng)皿加入10 mL無菌水，不斷攪拌均勻至固粉充分溶解，此為10-1菌懸液。用移液槍吸取1 mL上述菌懸液打入試管內(nèi)，用小量杯接取9 mL無菌水后倒入裝有菌懸液的試管內(nèi)，充分振蕩試管，此為10-2菌懸液。用移液槍吸取100 μL上述菌懸液打入試管內(nèi)，用小量杯接取10 mL無菌水后倒入裝有菌懸液的試管內(nèi)，充分振蕩試管，此為10-4菌懸液。依次制備10-6菌懸液、10-8菌懸液、10-10菌懸液。用移液槍吸取10-6菌懸液100 μL打入固體LB培養(yǎng)皿中心位置，用潔凈的涂布棒將菌懸液均勻涂布，對10-8菌懸液、10-10菌懸液，重復(fù)操作，每個梯度涂布2個培養(yǎng)皿。將完成涂布的培養(yǎng)皿封好封口膜，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。對3個梯度的培養(yǎng)皿進(jìn)行觀測，皿內(nèi)菌落數(shù)為20～300，則該皿可以用來計數(shù)。經(jīng)平板檢測，使用的貝萊斯芽孢桿菌菌株RJW-5-5的固體發(fā)酵次代菌株JW-5-AN的活孢子數(shù)為5×108 CFU/g。

1.2.3 平板對峙試驗初始條件設(shè)置。平板對峙試驗的初始菌物數(shù)量條件，以完全長滿PDA培養(yǎng)皿的煙草赤星病菌為原始病菌條件，以一打孔器口徑（直徑6 mm）為平板對峙試驗中煙草赤星病菌的接入量。操作流程：用接種環(huán)從JW-5-AN菌株試管中挑取芽孢桿菌，以肉眼可見接種環(huán)上載有芽孢桿菌為第一節(jié)點;將載有芽孢桿菌的接種環(huán)置于盛有100 μL 無菌水的離心管中攪拌，以肉眼可見接種環(huán)上的芽孢桿菌全部進(jìn)入離心管內(nèi)100 μL無菌水為第二節(jié)點;搖勻離心管，制成JW-5-AN芽孢桿菌菌懸液;再用移液槍吸取2 μL 菌懸液作為平板對峙試驗菌株JW-5-AN的接入量。

平板對峙試驗的初始空間條件，煙草赤星病菌于PDA培養(yǎng)皿的中心位置接入;貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN菌懸液于PDA培養(yǎng)皿直徑上，距圓心3 cm處的2點對稱位置接入。

2 結(jié)果與分析

2.1 貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN與煙草赤星病菌TBSD的平板對峙試驗 為描述貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌的拮抗能力，從兩方面設(shè)定評估標(biāo)準(zhǔn)。一是時間標(biāo)準(zhǔn)：從對峙起，以5、12 d為平板采樣觀測點，簡稱5 d樣本和12 d樣本。二是空間標(biāo)準(zhǔn)：5 d樣本中，煙草赤星病菌的最大長度、最小寬度、抑制直徑;12 d樣本中，煙草赤星病菌的最大長度、最小寬度、抑制直徑、邊沿遠(yuǎn)端距離。

2.1.1 平板對峙5 d樣本及分析。

經(jīng)過觀察及測量，貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN與煙草赤星病菌的平板對峙5 d樣本數(shù)據(jù)：煙草赤星病菌5 d最大長度56.9 mm，煙草赤星病菌5 d最小寬度29.1 mm，貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌的5 d抑制直徑為煙草赤星病菌5 d最大長度減去煙草赤星病菌5 d最小寬度，為27.8 mm。

定義貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌的一維拮抗能力值A(chǔ)1等于5 d抑制直徑，為27.8;定義貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌的進(jìn)攻型拮抗速率VAo等于5 d抑制直徑除以5，為27.8/5=5.56 mm/d（圖3）。

2.1.2 平板對峙12 d樣本及分析。

經(jīng)過觀察、測量及計算，貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN與煙草赤星病菌的平板對峙12 d樣本數(shù)據(jù)：煙草赤星病菌12 d最大長度84.2 mm;煙草赤星病菌12 d最小寬度30.0 mm;邊沿遠(yuǎn)端距離一50.0 mm;邊沿遠(yuǎn)端距離二47.0 mm;邊沿遠(yuǎn)端距離平均值為48.5 mm。

由12 d樣本，定義貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌的二維拮抗能力值A(chǔ)2等于邊沿遠(yuǎn)端距離平均值，為48.5 mm。定義貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌的防御型拮抗指數(shù)QAd等于邊沿遠(yuǎn)端距離平均值除以煙草赤星病菌12 d最大長度，為48.5/84.2=0.576 0（圖4）。

2.1.3 定義數(shù)值A(chǔ)1、VAo、A2、QAd。對于定義數(shù)值，一維拮抗能力A1、進(jìn)攻型拮抗速率VAo、二維拮抗能力A2、防御型拮抗指數(shù)QAd的解釋：在第一觀測時間點即5 d樣本中，近似認(rèn)為只存在一個方向D1（垂直于病菌生長的長邊方向）上的拮抗即一維拮抗，此時芽孢桿菌對于病菌的拮抗表現(xiàn)為進(jìn)攻型拮抗，定義進(jìn)攻型拮抗速率VAo，是為了找到一個可能的數(shù)據(jù)指標(biāo)來描述芽孢桿菌對病菌的殺菌速率;在第二觀測時間點即12 d樣本中，存在另一個方向D2（水平于病菌生長的長邊方向）上的拮抗即二維拮抗，此時芽孢桿菌對于病菌的拮抗表現(xiàn)為防御型拮抗，定義防御型拮抗指數(shù)QAd，是為了找到一個可能的數(shù)據(jù)指標(biāo)來描述芽孢桿菌對病菌的占位穩(wěn)定性。綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌的一維拮抗能力值為27.8，進(jìn)攻型拮抗速率值為5.56，二維拮抗能力值為48.5，防御型拮抗指數(shù)值為0.576 0。

2.2 平板對峙試驗中煙草赤星病菌樣本的顯微檢測

為了進(jìn)一步證實菌株JW-5-AN對煙草赤星病菌具有拮抗作用，在400倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行檢測，對比了平板對峙試驗培養(yǎng)皿內(nèi)，煙草赤星病菌生長范圍中，對峙最遠(yuǎn)處和最近處的煙草赤星病菌生長狀況。觀測照片見圖5、6。

對比圖5、6可以看出，與貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對峙最近處的煙草赤星病菌，相較于貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對峙最遠(yuǎn)處的煙草赤星病菌，出現(xiàn)顏色變深、膨大、斷裂現(xiàn)象。由此推斷，貝萊斯芽孢桿菌JW-5-AN對煙草赤星病菌有殺菌作用。

3 結(jié)論與討論

該研究初步判斷貝萊斯芽孢桿菌菌株RJW-5-5拮抗煙草赤星病菌。同時，該研究建立了一種新的描述方法，即對照平板對峙試驗的5、12 d聯(lián)合樣本，定義5 d抑制直徑、12 d邊沿遠(yuǎn)端距離平均值等平板對峙試驗參數(shù)，由此計算芽孢桿菌對于病菌的一維拮抗能力、進(jìn)攻型拮抗速率、防御型拮抗指數(shù)、二維拮抗能力指標(biāo)，以此增加平板對峙試驗的評價角度。

此外，該研究使用貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5的固體發(fā)酵次代菌株JW-5-AN與煙草赤星病菌進(jìn)行平板對峙試驗，經(jīng)過固體發(fā)酵，菌株JW-5-AN生長穩(wěn)定且經(jīng)過平板檢測，活菌數(shù)達(dá)5×108CFU/g。

該研究初步判斷貝萊斯芽孢桿菌RJW-5-5具有研發(fā)防治煙草赤星病微生物菌劑的潛力。

參考文獻(xiàn)

[1]郭映秀，陳德鳳.烤煙赤星病的發(fā)生規(guī)律及防治對策分析[J].種子科技，2020，38（11）：90，93.

[2]馬志遠(yuǎn).煙草赤星病菌拮抗芽孢桿菌的篩選、鑒定及應(yīng)用研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012.

[3]RUIZ-GARCA C，BJAR V，MARTNEZ-CHECA F，et al.Bacillus velezensis sp.nov.， a surfactant-producing bacterium isolated from the river Vélez in Málaga， southern Spain[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology，2005，55（Pt 1）：191-195.

[4]李姝江，梁漫，朱天輝，等.雜交竹梢枯病拮抗菌的篩選及抗菌蛋白分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，37（6）：27-32.

[5]徐婷，朱天輝，李姝江，等.貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis YB15β-葡聚糖酶的抑菌作用與基因克隆[J].中國生物防治學(xué)報，2014，30（2）：276-281.

[6]HUANG L，LI Q C，HOU Y，et al.Bacillus velezensis strain HYEB5-6 as a potential biocontrol agent against anthracnose on Euonymus japonicus[J].Biocontrol science and technology，2017，27（5）：636-653.

[7]馮志珍，陳太春，段軍娜，等.煙草黑脛病拮抗根際芽胞桿菌FB-16的篩選鑒定及其抑菌活性[J].植物保護(hù)學(xué)報，2012，39（3）：224-230.

[8]劉偉，劉鵬，沈小英，等.煙草青枯病拮抗芽孢桿菌的篩選、鑒定及其抑菌活性初探[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，42（2）：123-130.

[9]安德榮.植物病毒化學(xué)防治的研究現(xiàn)狀和所面臨的問題[J].生命科學(xué)，1994，6（2）：15-18.

[10]安德榮.陜西省煙草病毒病的發(fā)生、流行成因及防治技術(shù)[J].中國煙草科學(xué)，2002，23（1）：46-48.