郝廣煜，方 剛，代玉晶，李 娟，侯瑞麗，賈建新，楊占君，霍東升

(包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

人參屬植物具有重大的藥用價(jià)值，人參(Panax ginseng Meyer)和三七(P. notoginseng (Burk) F. H. Chen)都是人參屬植物中的藥材。人參皂苷Rb1是從人參提取出的最豐富的生物活性形式，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等生物活性[1]。研究證實(shí)，神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生與機(jī)體的氧化產(chǎn)物水平增加有著密切的關(guān)系。腦內(nèi)含有大量的脂質(zhì)且耗氧量較高，活性氧(reactive oxygen species, ROS)蓄積引起的損傷可能是疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[2]。因此，延緩神經(jīng)退行性疾病的有效治療方法之一可能就是通過抗氧化劑清除過量的ROS。H2O2屬于活性氧自由基，為主要的ROS之一，是引起氧化應(yīng)激的一個(gè)中介物。PC12細(xì)胞來源于褐家鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤，在體外培養(yǎng)時(shí)與神經(jīng)元生長(zhǎng)特征相似，廣泛應(yīng)用于研究神經(jīng)細(xì)胞的功能、分化和死亡領(lǐng)域。趙立理等研究發(fā)現(xiàn)H2O2可引起PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞活力下降[3]。帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一種常見的老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，致病過程復(fù)雜，氧化應(yīng)激是其眾多致病因素之一。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2構(gòu)建PC12細(xì)胞損傷模型，通過檢測(cè)細(xì)胞活性，探討人參皂苷Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷模型的影響，為人參皂苷在PD方面的治療研究提供理論參考依據(jù)，同時(shí)也為中藥材資源的開發(fā)與利用積累資料。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 PC12大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。人參皂苷Rb1購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、馬血清為美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司；RNAiso plus、PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 均購(gòu)自TaKaRa大連公司；引物HO-1和GCLC由生工生物工程(上海)有限公司合成；DMSO和青霉素、鏈霉素購(gòu)自?？寺∩锘瘜W(xué)制品(北京)有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自sigma公司；30 %過氧化氫(H2O2)購(gòu)自天津富宇試劑有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞用含5 %胎牛血清、5 %馬血清、100 mg/L青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞按1×105個(gè)/mL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2條件下孵育12 h后，分別加入系列濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL) 的人參皂苷Rb1。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(未加人參皂苷Rb1)，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光度值(OD 570 nm)。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率=[(藥物孔OD值-本底對(duì)照孔OD值) /(對(duì)照細(xì)胞孔OD值-本底對(duì)照孔OD值)]×100 %計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3人參皂苷Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 取對(duì)數(shù)期PC12 細(xì)胞，濃度調(diào)整為1×105個(gè)/mL并接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加100 μL，37 ℃、5 % CO2條件下孵育12 h后，棄去原培養(yǎng)液，將PC12細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組和實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)組加入系列濃度的人參皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)溶液，模型組和對(duì)照組加入DMEM完全培養(yǎng)基，終體積為100 μL/孔，預(yù)處理12 h。待處理結(jié)束后，模型組和實(shí)驗(yàn)組直接加入H2O2溶液，終濃度為400 μmol/L，對(duì)照組加入等體積DMEM完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置5個(gè)平行孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入新配制的5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃避光孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的吸光度值(OD 570 nm)并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4HO-1和GCLC基因的轉(zhuǎn)錄水平分析 按上述方法培養(yǎng)細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，重懸于1 mL RNAiso plus中提取總RNA。以0.5 μg RNA為模板按 PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴(kuò)增引物：HO-1 forward (5'-GCCTGCTAGCCTGGTTCAAG-3') 和HO-1 reverse (5'-AGCGGTGTCTGGGATGAACTA-3')[4]；GCLC forward (5'-GTCCTCAGGTGACATTCCAAGC-3') 和GCLC reverse (5'-TGTTCTTCAGGGGCTCCAGTC-3') ；GAPDH forward (5'-AAGCTGGTCATCAACGGGAAAC-3') 和GAPDH reverse (5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACG-3') ，反應(yīng)體系按照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ反應(yīng)液配制說明配制。檢測(cè)樣品做3個(gè)重復(fù)，且至少3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃，30 s；95 ℃，5 s；60 ℃，34 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析通過待測(cè)基因與內(nèi)參基因Ct值的差值來計(jì)算基因表達(dá)差異，即基因表達(dá)水平變化倍數(shù)= 2-[(干預(yù)后待測(cè)基因-干預(yù)后參照基因)-(干預(yù)前待測(cè)基因-干預(yù)前參照基因)]。

2 結(jié)果

2.1人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法檢測(cè)人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果顯示，與空白組比較，人參皂苷Rb1系列濃度(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)對(duì)PC12細(xì)胞的增殖作用無顯著性差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)人參皂苷Rb1對(duì)細(xì)胞增殖無影響，無細(xì)胞毒性作用(圖1)。

2.2人參皂苷Rb1對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的影響 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率如圖2所示，與正常對(duì)照組比較，模型組顯著地降低PC12細(xì)胞存活率(P<0.001)；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組不同濃度人參皂苷Rb1(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL)培養(yǎng)24 h后細(xì)胞的存活率升高，且呈劑量依賴性增高，0.2 mg/mL和0.4 mg/mL組細(xì)胞存活率顯著性增高(P<0.001)。

圖1 人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

圖2 人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

2.3人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞的HO-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響 利用qRT-PCR方法，檢測(cè)人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞HO-1基因的轉(zhuǎn)錄水平的影響。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，人參皂苷Rb1(0.4 mg/mL)組的HO-1基因轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.001，圖3A)，而對(duì)照組的HO-1基因轉(zhuǎn)錄水平無顯著性差異(P>0.05，圖3A)；人參皂苷Rb1(0.4 mg/mL)組的GCLC基因轉(zhuǎn)錄水平與模型組、對(duì)照組均無顯著性差異(P>0.05，圖3B)。

圖3 人參皂苷Rb1對(duì)PC12細(xì)胞的HO-1

3 討論

目前，針對(duì)PD不同病因已在體外建立了多種細(xì)胞模型，例如氧化應(yīng)激損傷模型、缺糖缺氧模型等，它們具有周期短、條件易控、便于重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。PC12細(xì)胞有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞特征，且易存活、可傳代、增殖快，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物篩選及機(jī)制研究中[5]。大量研究表明，自由基損傷是造成PD的重要原因之一，其中ROS與PD發(fā)病有著密切的關(guān)系。ROS生成過多而體內(nèi)活性酶的清除能力下降，使得機(jī)體處于氧化應(yīng)激環(huán)境之中[6,7]。H2O2作為氧化損傷的誘導(dǎo)劑，化學(xué)性質(zhì)活躍，易于出入細(xì)胞，引起細(xì)胞毒性而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞毒性檢測(cè)主要根據(jù)細(xì)胞膜通透性的變化。常用的檢測(cè)方法有MTT、CCK8和LDH等，用于檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)(RealTime Cellular Analysis，RTCA)是近幾年出現(xiàn)的新技術(shù)手段，可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、定量跟蹤細(xì)胞形態(tài)和增殖分化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組的細(xì)胞存活率顯著低于正常對(duì)照組，提示H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型成功建立。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率高于模型組，呈劑量依賴性增高，劑量達(dá)到0.2 mg/mL出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明人參皂苷Rb1能夠降低PC12細(xì)胞中H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。目前大量的研究證據(jù)表明，ROS不但有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞活性生理功能，還可參與介導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)的生物學(xué)活性作用及直接或間接損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)[8]。H2O2暴露可增加細(xì)胞內(nèi)ROS或直接參與氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。人參皂苷Rb1可能是通過其抗氧化活性減少自由基產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激，從而對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

血紅素加氧酶(heme oxygenase, HO)是血紅素分解代謝過程中的限速酶。HO有三種類型：氧應(yīng)激誘導(dǎo)型HO-1、組成型HO-2及尚未明確的HO-3。HO -1本身及其代謝產(chǎn)物均有抗氧化損傷的功能，臨床上以HO-1的表達(dá)量作為組織氧化應(yīng)激水平的重要參考。研究證實(shí)，HO-1基因的上調(diào)對(duì)細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用[9]。本研究結(jié)果顯示人參皂苷Rb1能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)HO-1基因表達(dá)，提示人參皂苷Rb1可能通過上調(diào)HO-1基因表達(dá)發(fā)揮對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，其上調(diào)機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，人參皂苷Rb1能夠?qū)笻2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞存活率，起到保護(hù)作用。人參皂苷Rb1可能是通過上調(diào)HO-1基因表達(dá)，增加抗氧化能力，降低氧化應(yīng)激損傷而完成，具體機(jī)制還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。