張 凌，張 旋，程 峣，廖 鑫

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 貴州遵義 563003

糖尿病是一種慢性病，發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。糖尿病心肌病是常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，其發(fā)病機(jī)制與心肌細(xì)胞損傷密切相關(guān)[2]。目前，糖尿病心肌病尚缺乏高效的治療方法[3]。探究影響心肌細(xì)胞損傷的分子機(jī)制，可為糖尿病心肌病的治療提供新途徑。miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性小分子RNA，可靶向調(diào)控其靶基因的表達(dá)，參與多種心肌疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。有報(bào)道[5]稱，miR-1306-5p在心力衰竭患者的心肌組織中高表達(dá)。水通道蛋白1(aquaporin 1,AQP1)是與轉(zhuǎn)運(yùn)水相關(guān)的同源性內(nèi)在膜蛋白，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等[6]。有研究[7]表明，糖尿病大鼠心肌組織中AQP1表達(dá)下降，上調(diào)AQP1表達(dá)可緩解糖尿病心肌病變。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)人心肌細(xì)胞AC16，探究miR-1306-5p能否靶向作用于AQP1并調(diào)控高糖誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白的表達(dá)及凋亡，以期為糖尿病心肌病變的治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1材料AC16細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海分院)，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，蛋白提取試劑盒、BCA蛋白試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Santa Cruz公司)，ECL發(fā)光液(R&D公司)，AQP1、心房利鈉因子(ANF)、肌球蛋白重鏈β(β-MHC)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、Bax、Bcl-2一抗(CST公司)，二抗(博奧森生物技術(shù)有限公司)。

1.2高糖對(duì)AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白、miR-1306-5p和AQP1表達(dá)的影響AC16細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AC16細(xì)胞，以每孔2.5×104個(gè)接種于24孔板。細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)約60%時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。對(duì)照組細(xì)胞用含5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基孵育24 h，高糖(HG)組用含33 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基孵育24 h。

收集細(xì)胞上清液，混勻，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平。

采用Western blot法檢測(cè)心肌病變相關(guān)蛋白(ANF、β-MHC和TGF-β)及AQP1的表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜；體積分?jǐn)?shù)5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h；加一抗(ANF、β-MHC、TGF-β及AQP1抗體均按1∶500稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBS清洗3次，5 min/次；加二抗搖床孵育1 h，TBS清洗3次，5 min/次；ECL顯影液顯色，AI600凝膠成像儀觀察，采集圖片，以目的蛋白條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，取1 μg，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。miR-1306-5p上游引物5’-GGCTGTTTCTGGCTGTTACTG-3’，下游引物5’-AACACCCATTCCCTTCACAG-3’；U6上游引物5’-ATGTACGTAGCCATCCAGGC-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；AQP1上游引物5’-CCGAGACTTAGGTGGCTCAG-3’，下游引物5’-ATGCG GTCTGTAAAGTCGCT-3’；β-actin上游引物5’-AC CACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物5’-TC CACCACCCTGTTGCTGTA-3’。反應(yīng)體系：2×SYBR Mix 10 μL，10×cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，H2O 8.0 μL；反應(yīng)程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。分別以U6、β-actin為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1306-5p、AQP1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3抑制miR-1306-5p表達(dá)對(duì)高糖處理的AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響AC16細(xì)胞同上培養(yǎng)，均以每孔2.5×104個(gè)接種于24孔板。高糖處理24 h后分為3組，HG組、HG+anti-miR-con組和HG+anti-miR-1306-5p，后2組高糖處理后參照l(shuí)ipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)，分別轉(zhuǎn)染miR-1306-5p抑制劑陰性對(duì)照(anti-miR-con)和miR-1306-5p抑制劑(anti-miR-1306-5p),均由美國(guó)Ambion?Life Technologies公司合成。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集各組細(xì)胞，同上檢測(cè)心肌酶的分泌及心肌病變相關(guān)蛋白的表達(dá)。

另取3組細(xì)胞約5×106個(gè)，1 000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)基；PBS清洗1次，4 ℃、體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定1～2 h，棄去固定液，PBS清洗；1 mL PI染液染色，4 ℃避光孵育30 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

采用Western blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)(一抗按1∶500稀釋)，方法同上。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.4miR-1306-5p與AQP1靶向關(guān)系的測(cè)定用TargetScan生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-1306-5p與AQP1 3’UTR的結(jié)合位點(diǎn)。采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-1306-5p與AQP1的靶向關(guān)系。構(gòu)建野生型AQP1 3’UTR(AQP1 3’UTR-WT)和突變型AQP1 3’UTR(AQP1 3’UTR-MUT)質(zhì)粒，采用LipofectamineTM2000分別將miR-con、miR-1306-5p與AQP1 3’UTR-WT、AQP1 3’UTR-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至AC16細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后使用熒光檢測(cè)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，以海腎熒光酶活性為內(nèi)參。同時(shí)取AC16細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，高糖處理24 h后分為4組，分別轉(zhuǎn)染miR-con、miR-1306-5p、anti-miR-con和anti-miR-1306-5p，48 h后采用Western blot法檢測(cè)AQP1蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.5同時(shí)抑制miR-1306-5p和AQP1表達(dá)對(duì)高糖處理的AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響AC16細(xì)胞同上培養(yǎng)，均以每孔2.5×104個(gè)接種于24孔板。高糖處理24 h后分為4組，HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-1306-5p組、HG+anti-miR-1306-5p+si-con組和HG+anti-miR-1306-5p+si-AQP1組，分別轉(zhuǎn)染anti-miR-con、anti-miR-1306-5p、anti-miR-1306-5p與亂序無(wú)意義陰性序列以及anti-miR-1306-5p與AQP1小干擾RNA(si-AQP1)。轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后同上檢測(cè)心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白的表達(dá)、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。對(duì)照組和HG組AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白、miR-1306-5p和AQP1表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白及心肌病變相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1高糖對(duì)AC16細(xì)胞心肌酶的分泌及心肌病變相關(guān)蛋白、miR-1306-5p和AQP1表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，HG組CK、LDH、AST水平，ANF、β-MHC、TGF-β蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，說(shuō)明高糖會(huì)對(duì)AC16細(xì)胞造成一定程度的損傷，且可誘導(dǎo)AC16細(xì)胞病變。與對(duì)照組比較，HG組miR-1306-5p表達(dá)升高，AQP1 mRNA和蛋白的表達(dá)降低(圖1、表1)。

1：對(duì)照組；2：HG組

表1 2組細(xì)胞心肌酶分泌、心肌病變相關(guān)蛋白、miR-1306-5p和AQP1表達(dá)水平的比較(n=3)

2.2抑制miR-1306-5p對(duì)高糖誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與HG組和HG+anti-miR-con組比較，HG+anti-miR-1306-5p組AC16細(xì)胞心肌酶的分泌減少，心肌病變相關(guān)蛋白的表達(dá)降低，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖2、3和表2)。

2.3miR-1306-5p與AQP1靶向關(guān)系的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證結(jié)果miR-1306-5p與AQP1 3’UTR結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。miR-1306-5p與AQP1 3’UTR-WT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性降低，而與AQP1 3’UTR-MUT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化，提示miR-1306-5p與AQP1 3’UTR有靶向關(guān)系。HG+miR-con組、HG+miR-1306-5p組、HG+anti-miR-con組、HG+anti-miR-1306-5p組AQP1蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖5，其水平分別為(1.00±0.15)、(0.39±0.06)、(1.00±0.14)和(2.13±0.17)，4組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=254.381，P<0.001)；HG+miR-1306-5p組AQP1蛋白表達(dá)水平低于HG+miR-con組，HG+anti-miR-1306-5p組AQP1蛋白表達(dá)水平高于HG+anti-miR-con組，進(jìn)一步證實(shí)miR-1306-5p負(fù)調(diào)控AQP1蛋白的表達(dá)。

1：HG組；2：HG+anti-miR-con組；3：HG+anti-miR-1306-5p組

1：HG組；2：HG+anti-miR-con組；3：HG+anti-miR-1306-5p組

表2 3組細(xì)胞心肌酶分泌、心肌病變相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(n=3)

圖4 miR-1306-5p與AQP1 3’UTR結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

1:HG+miR-con組;2:HG+miR-1306-5p組;3:HG+anti-miR-con組;4:HG+anti-miR-1306-5p組

2.4同時(shí)抑制miR-1306-5p和AQP1的表達(dá)對(duì)高糖處理的AC16細(xì)胞心肌酶的分泌、心肌病變相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)圖6、7，表4。與HG+anti-miR-1306-5p+si-con組比較，HG+anti-miR-1306-5p+si-AQP1組CK、LDH和AST水平及ANF、β-MHC和TGF-β蛋白表達(dá)水平升高，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，說(shuō)明抑制AQP1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-1306-5p對(duì)心肌病變的保護(hù)作用。

1：HG+anti-miR-con組；2：HG+anti-miR-1306-5p組；3：HG+anti-miR-1306-5p+si-con組；4：HG+anti-miR-1306-5p+si-AQP1組

表4 同時(shí)抑制miR-1306-5p和AQP1的表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的AC16細(xì)胞心肌酶分泌、心肌病變相關(guān)蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(n=3)

3 討論

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康[8-9]。盡管糖尿病心肌病的治療取得了較大進(jìn)展，但仍存在一定缺陷，如治療藥物副作用較大[10]。因此，仍需要探究糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)。研究[11]顯示，糖尿病心肌病的發(fā)病機(jī)制與心肌細(xì)胞的損傷密切相關(guān)。高糖可引起細(xì)胞線粒體膜電位異常，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷對(duì)于糖尿病心肌病的治療具有重要意義[12]。心肌損傷時(shí)，心肌酶CK、LDH和AST的表達(dá)升高[13]。ANF、β-MHC、TGF-β是心肌細(xì)胞肥大相關(guān)因子。齊迎春等[14]研究顯示，大鼠肥厚心肌組織中ANF、β-MHC、TGF-β高表達(dá)，沉默其表達(dá)可以抑制心肌細(xì)胞肥大。本研究結(jié)果顯示，高糖處理后心肌細(xì)胞AC16中心肌酶CK、LDH和AST的分泌增加，心肌病變相關(guān)蛋白ANF、β-MHC和TGF-β蛋白的表達(dá)水平升高，說(shuō)明高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型成功建立。

miRNA是真核生物中廣泛存在的一類(lèi)小分子非編碼RNA，可通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)影響心肌細(xì)胞的生命活動(dòng)[15]。Song等[16]的研究顯示，miR-144通過(guò)靶向CTRP3/JNK信號(hào)通路調(diào)控高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞AC16增殖和凋亡，可作為糖尿病心肌病的治療靶點(diǎn)。Cheng等[17]的研究顯示，lncRNA Malat1的敲低可通過(guò)促進(jìn)miR-181a-5p表達(dá)來(lái)減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。另有報(bào)道[5]，心力衰竭患者心肌組織中miR-1306-5p呈高表達(dá)。但目前，miR-1306-5p在糖尿病心肌病中的作用還未知。本研究結(jié)果顯示，高糖可促進(jìn)心肌細(xì)胞AC16中miR-1306-5p的表達(dá)，提示miR-1306-5p可能參與高糖作用后的心肌細(xì)胞病變；抑制miR-1306-5p表達(dá)可降低高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中CK、LDH和AST的分泌及ANF、β-MHC和TGF-β蛋白的表達(dá)水平，說(shuō)明抑制miR-1306-5p表達(dá)可減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。心肌細(xì)胞凋亡在心肌病變中起重要作用。本研究顯示，抑制miR-1306-5p的表達(dá)可顯著減少細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷。

為了進(jìn)一步探討抑制miR-1306-5p保護(hù)高糖作用下心肌細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究通過(guò)雙熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)和Western blot證實(shí)了miR-1306-5p在心肌細(xì)胞中靶向負(fù)調(diào)控AQP1表達(dá)，這也與高糖促進(jìn)miR-1306-5p表達(dá)而抑制AQP1表達(dá)的結(jié)果一致。研究[18]顯示，AQP1在缺血缺氧小鼠心肌細(xì)胞中表達(dá)降低，參與心肌損傷的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，抑制AQP1表達(dá)減弱了抑制miR-1306-5p表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，表現(xiàn)為CK、LDH、AST的分泌增多，ANF、β-MHC、TGF-β、Bax蛋白表達(dá)升高，心肌細(xì)胞凋亡增加，提示抑制miR-1306-5p表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)AQP1的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。

綜上所述，高糖可損傷心肌細(xì)胞，抑制miR-1306-5p表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)AQP1表達(dá)減輕高糖對(duì)心肌細(xì)胞的損傷，為靶向治療糖尿病心肌病變提供了新思路。