辛國芹， 汪祥燕， 寧慧宇， 徐海燕， 谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司，山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東泰安271000）

益生菌是指定植于動物機體， 能夠促進宿主微生態(tài)平衡、 促進營養(yǎng)吸收等有益于宿主的活性微生物。 其具有抑制病原菌、 促進營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、綠色、安全無污染等優(yōu)勢，隨著禁抗時代的到來， 益生菌被認為是飼用抗生素的最佳替代品之一（李雯靜等，2013；董秋月等2012）。 枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌的一種，具有耐高溫、耐酸堿、抗逆性強、易貯存等優(yōu)點，因具有改善消化道內(nèi)環(huán)境、促生長、提高免疫力及分泌產(chǎn)生多種消化酶等功能而得到廣泛應(yīng)用 （何明清等，2004）， 早在1999 年就被農(nóng)業(yè)部列為可直接添加到飼料中的綠色添加劑（陶榮霞，2012）。

枯草芽孢桿菌作為理想的微生態(tài)制劑， 對常見畜禽病原菌有良好的抑菌效果。研究證明，來源于動物腸道的益生菌可發(fā)揮更好的定植及腸道益生功效（周珍輝等，2017）。目前關(guān)于芽孢菌產(chǎn)酶抑菌性能的報道較多， 但關(guān)于對飼料消化性能的研究相對較少。 本研究對試驗分離的豬源枯草芽孢桿菌，研究其抑菌、產(chǎn)酶性能，并利用模擬消化試驗研究小鼠對不同飼料組合的消化作用， 進一步測定其飼喂安全性，為畜禽養(yǎng)殖提供可抑菌、促消化進而改善畜禽營養(yǎng)消化吸收且安全的芽孢菌，以期為優(yōu)良菌株的篩選提供基礎(chǔ)， 為枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑的研發(fā)提供菌種儲備及應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用菌種 菌株：枯草芽孢桿菌BL-Y9由山東寶來利來生物研究院從新鮮豬糞中分離，經(jīng)數(shù)次傳代，活性穩(wěn)定。

指示菌：豬大腸桿菌K88、雞大腸桿菌O78、雞白痢沙門氏菌CVCC533 均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC）； 金黃色葡萄球菌C56011 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）。

1.1.2 試驗動物 健康昆明種小白鼠，體重（20±2）g，購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，合格證號：SCXK（魯）2013-0001。

1.1.3 飼料原料 選擇常見的飼料原料玉米、豆柏、麩皮、棉籽粕4 種，60 ℃烘干后粉碎，過40 目篩，按一定比例組合備用，如表1 所示。

表1 不同飼料組合原料配方 %

1.1.4 培養(yǎng)基及試劑 芽孢菌斜面培養(yǎng)基： 蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、NaCl 5 g、瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。芽孢菌液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2 g、 酵母膏5 g、 蛋白胨10 g、NaCl 5 g， 蒸餾水1000 mL，pH 7.0。 指示菌發(fā)酵培養(yǎng)基：同芽孢桿菌液體種子培養(yǎng)基。抑菌試驗檢測培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂（NA）。

BCA 法測可溶性蛋白試劑A 的配制：2.5 g BCA 二鈉鹽，5 g 無水碳酸鈉，0.4 g 酒石酸鈉，1 g氫氧化鈉，2.4 g 碳酸氫鈉， 加250 mL 水溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至11.25。BCA 法測可溶性蛋白試劑B 的配制：2 g 五水硫酸銅， 加50 mL 水溶解。BCA 工作液由100 mL 試劑A 和2 mL 試劑B混合，現(xiàn)配現(xiàn)用，可穩(wěn)定一周。

本研究中所需其他試劑及溶液均按常規(guī)自行配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 指示菌發(fā)酵液的制備 將指示菌斜面接種到裝有50 mL 液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、180 r/min 條件下恒溫振蕩培養(yǎng)18 h。

1.2.2 代謝產(chǎn)物的制備 將BL-Y9 接種在斜面培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)復(fù)壯，24 h 后傳代到裝有30 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中，37 ℃、180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)芽孢率80%以上，5000 r/min 離心10 min， 取上清液經(jīng)細菌濾器過濾（濾膜直徑為220 nm）， 收集濾液即為代謝產(chǎn)物，然后用打孔法對代謝產(chǎn)物進行抑菌活性測定。方法如下：用0.9%的滅菌生理鹽水將病原菌原發(fā)酵液稀釋至106cfu/mL， 吸取稀釋好的病原菌使用液0.6 mL 加入平板中，無菌操作吸取15 mL 冷卻至50 ℃左右滅菌的營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，加入到上述已加病原菌的平板中，混勻，平板冷卻后用2.7 mm 的直徑打孔器打孔，每孔分別注入10 μL樣品處理液。 正置2 h 后，再倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h。 每個樣品做三個平行。

1.2.3 發(fā)酵液中性蛋白酶及纖維素酶酶活的測定 中性蛋白酶酶活的測定采用福林酚法，酶活力定義為：1 mL 酶液（1 g 酶粉）在40 ℃、pH 7.5的條件下， 每分鐘內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg 酪氨酸所需的酶量為1 個蛋白酶活力單位， 以U/mL（U/g）表示。

纖維素酶酶活測定采用CMC 糖化力法，酶活定義為：1 mL 液體酶在40 ℃、pH 4.6 條件下，每分鐘水解羧甲基纖維素鈉（CMC）產(chǎn)生1.0 μg 的葡萄糖，即為一個酶活力單位，以U/mL 表示。

1.2.4 枯草芽孢桿菌BL-Y9 對不同組合飼料的消化對比試驗

1.2.4.1 模擬消化試驗 稱取不同類型飼料組合10 g 于250 mL 的三角瓶中，121 ℃滅菌30 min加入50 mL 的無菌水， 用HCl 溶液調(diào)節(jié)pH 至3.0，加入備用的菌液1 mL，搖勻后靜置30 min 后用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至6.7，加入10%豬膽酸鹽溶液至終濃度為0.05%，37 ℃、50 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，60 ℃烘干后測定干物質(zhì)、粗纖維、還原糖、可溶性蛋白等含量。

1.2.4.2 還原糖的測定 采用DNS 比色法，參考GB/T23881-2009。取0.5 mL 消化完成后過濾的濾液于25 mL 具塞刻度試管，加入蒸餾水和DNS 溶液各1.5 mL，沸水浴10 min，取出立刻冷卻并定容至25 mL，540 nm 條件下比色。 根據(jù)OD540nm吸光度在標準曲線中查得還原糖濃度， 將單位換算成每克組合飼料中含還原糖的毫克數(shù)。

1.2.4.3 游離氨基酸的測定 采用福林酚法，參考GB/T23527-2009，取1 mL 濾液加入10 mL 離心管，加入2 mL 65.4 g/L 的三氯乙酸，4000 r/min離心5 min。取1 mL 上清加入5 mL 44.2 g/L 碳酸鈉溶液，加入1 mL 福林酚試劑，40 ℃條件下水浴20 min，測OD680nm值。

1.2.4.4 可溶性蛋白含量的測定 采用BCA 二鈉法，取適當(dāng)稀釋倍數(shù)的濾液50 μL 于10 mL 離心管，加入1 mL BCA 工作液，混勻后，56 ℃水浴30 min，測OD562nm值。

1.2.4.5 酸溶蛋白含量的測定 采用BCA 二鈉法，取20 倍稀釋的濾液1 mL 于10 mL 離心管，加入1 mL 15%TCA 溶液，靜置30 min，4000 r/min 離心10 min， 取出50 μL 上清液加入1 mL BCA 工作液，混勻后，56 ℃水浴30 min，測OD562nm值。

1.2.4.6 粗纖維含量的測定 參照GB/T6434-2006 方法測定消化殘渣干物質(zhì)中粗纖維含量。

1.2.5 菌株BL-Y9 對小鼠的安全性試驗 灌胃菌液的制備： 將待測菌株以2%接種量接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h，將菌液轉(zhuǎn)置無菌離心管中，4000 r/min 離心5 min，收集菌體， 分別加入無菌生理鹽水及上清液混勻，調(diào)至活菌數(shù)濃度分別為1.0×108、1.0×109、1.0×1010cfu/0.2 mL。

試驗方法： 清潔級雄性昆明小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后，進行隨機分組，分為對照組、不同劑量組，每組10 只。 分組時做好標記，對照組使用生理鹽水，不同劑量組分別灌胃不同活菌數(shù)的菌懸液， 每只0.2 mL，每天灌胃1 次。 試驗中觀察小鼠的各項指標，并做好記錄。 飼喂一周后進行剖殺，計算小鼠體重變化， 解剖觀察肝臟、 脾臟及腎臟有無病變。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株BL-Y9 發(fā)酵液抑菌及產(chǎn)酶性能

2.1.1 抑菌性能 由表2 可以看出，菌株BL-Y9對供試病原菌抑制效果較好， 對雞大腸桿菌O78抑菌效果優(yōu)于豬大腸桿菌K88， 對雞白痢沙門氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑達到13.33 mm。

表2 菌株BL-Y9 體外抑菌圈直徑 mm

2.1.2 產(chǎn)酶性能 如表3 所示， 菌株BL-Y9 在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h 芽孢率約為95%左右，測得發(fā)酵上清液中性蛋白酶、纖維素酶酶活分別達到184.98、9.68 U/mL， 中性蛋白酶活性高于劉秀俠 （2019） 報道的最高酶活產(chǎn)生菌BLLL-2 發(fā)酵上清液約50 U/mL。

表3 菌株BL-Y9 粗酶液酶活 U/mL

2.2 菌株BL-Y9 對不同組合飼料的體外消化對比試驗

2.2.1 干物質(zhì)消化率 如圖1 所示， 三種飼料組合經(jīng)菌株BL-Y9 處理后干物質(zhì)消化率差別較大，對玉米面+豆粕組合干物質(zhì)消化率較高，為37.79%，玉米面+棉籽粕組合干物質(zhì)消化率最低，為18.25%，比前者低19.54%。

圖1 3 種組合飼料經(jīng)枯草芽孢桿菌BL-Y9 處理后消化液干物質(zhì)消化率

2.2.2 游離氨基酸含量 如圖2 所示， 三種飼料組合經(jīng)菌株BL-Y9 處理后游離氨基酸含量增加幅度差別不大，都在150%以上，且以玉米面+麩皮組合游離氨基酸含量增加幅度最大，為168.6%。

2.2.3 可溶性蛋白含量 如圖3 所示， 三種飼料組合經(jīng)菌株BL-Y9 作用72 h 后可溶性蛋白含量增加明顯，與空白對照組相比，玉米面+豆粕組合可溶性蛋白增加幅度最高，為438.11%。

圖2 3 種組合飼料經(jīng)枯草芽孢桿菌BL-Y9 處理后消化液中游離氨基酸增加幅度

圖3 3 種組合飼料經(jīng)枯草芽孢桿菌BL-Y9 處理后消化液中可溶性蛋白增加幅度

2.2.4 還原糖含量 如圖4 所示， 三種飼料組合經(jīng)菌株BL-Y9 作用后與空白對照組相比還原糖含量增加明顯， 以玉米面+麩皮組合還原糖含量增加幅度最高，為468.67%；其次為玉米面+豆粕組合，增加幅度為325.62%，玉米面+棉籽粕組合增加幅度最低，為233.16%。

圖4 3 種組合飼料經(jīng)枯草芽孢桿菌BL-Y9 處理后消化液中還原糖含量增加幅度

2.2.5 酸溶蛋白含量 如圖5 所示， 三種飼料組合經(jīng)菌株BL-Y9 作用后酸溶蛋白含量增加明顯，以玉米面+麩皮組合含量增加幅度最高，為176.72%，其次為玉米面+棉籽粕組合，增加幅度為131.39%。

2.3 小鼠安全性試驗 各組小鼠灌胃處理，正常飼養(yǎng)期間觀察各組小鼠的體態(tài)、體征及毛色，試驗結(jié)束后各組之間均無肉眼可見的差異， 飼喂一周后進行剖殺， 對各組小鼠的體重及臟器指數(shù)進行分析，結(jié)果如表4 所示。經(jīng)口給予不同劑量受試物7 d 后，各組小鼠的體重?zé)o顯著性差異。試驗組小鼠體態(tài)正常， 肝臟、 脾臟和腎臟均無肉眼可見變化，臟器指數(shù)無顯著差異，表明菌株BL-Y9 在灌胃1 ～100 億的劑量對小鼠是安全的。

圖5 3 種組合飼料經(jīng)枯草芽孢桿菌BL-Y9 處理后消化液中酸溶蛋白增加幅度

表4 各組小鼠的體重、臟器指數(shù)及表征觀察

3 討論

3.1 枯草芽孢桿菌的抑菌性能 枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑， 飼喂后動物腸道內(nèi)的大腸桿菌、沙門氏菌等致病菌的數(shù)量顯著降低，枯草芽孢桿菌在畜牧業(yè)疾病治療中不會產(chǎn)生耐藥性和藥物殘留等問題， 這一優(yōu)勢使得該益生菌產(chǎn)品在控制養(yǎng)殖疾病方面替代抗生素的使用成為可能。 研究表明，枯草芽孢桿菌及其代謝物能顯著提高機體抵抗力 （李震，2012）， 減少禽畜發(fā)病率， 防治效果已經(jīng)達到和超過飼用抗生素的療效，對動物后期的恢復(fù)效果最為明顯。 張媛媛等（2014）發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌PB6 菌株培養(yǎng)液的抗菌譜較廣， 對多種病原菌均表現(xiàn)出不同程度的抑菌作用。 對常見腸道致病菌大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、 金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌均存在抑菌性，且抑菌效果相近。 陳天游等（2004）發(fā)現(xiàn)，枯草芽抱桿菌BS23 對所研究的幾種腸道病原菌生長均具有抑制作用， 其中以對抑制致病性大腸埃希氏菌和產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌的生長最為明顯。 孫瑞鋒等（2008）試驗表明，枯草芽抱桿菌制劑可顯著降低肉雞腸道中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。 本研究中的枯草芽孢桿菌BLY9 對豬源大腸桿菌雞源沙門氏菌、 金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到10 ～13 mm， 對多種常見腸道致病菌具有不同程度的抑菌性， 表明該菌在腸道內(nèi)能夠發(fā)揮一定程度的抑制有害菌生長，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，減少動物疾病發(fā)生的作用。

3.2 枯草芽孢桿菌對飼料的消化作用 芽孢桿菌能夠分泌活性較強的蛋白酶、 纖維素酶等一系列消化酶， 提高動物機體對飼料的消化利用率，提高動物的生長性能。 研究表明，添加不同劑量枯草芽孢桿菌， 肉雞平均日增重和料重比均得到極顯著改善， 同時也顯著提高了整個雞群的成活率和肉雞的生產(chǎn)性能（郭瑞萍，2019）。除此之外，飼喂枯草芽孢桿菌，可提高肉雞的生長性能， 改善盲腸微生物群組成及盲腸中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生， 可應(yīng)對肉雞養(yǎng)殖過程中壞死性腸炎（NE）的暴 發(fā)和恢復(fù)（Aljumaah Mashael 等2020）。 在妊娠后期和泌乳期向母豬的飼料中添加4.0×108cfu/kg 枯草芽孢桿菌PB6 可以縮短仔豬的生育間隔，提高乳豬的生長性能，并改善母豬后期妊娠的腸道健康 （Qianqian Zhang 等，2020）。 飼糧添加枯草芽孢桿菌制劑雖然不影響母豬繁殖性能， 但可增強機體對蛋白質(zhì)的利用和免疫力，降低仔豬腹瀉率（韓麗等，2017）；斷奶仔豬日糧中添加0.2%的枯草芽孢桿菌， 可提高斷奶仔豬的平均日增重、 平均日采食量及免疫球蛋白含量， 并對提高斷奶仔豬的抗氧化性有促進作用（魏立民等，2017）。 枯草芽孢桿菌除了能提高畜禽飼料消化率， 也能增加水產(chǎn)動物消化酶活性， 提高生產(chǎn)性能。 Ziaei-Nejad 等（2006）報道，芽孢桿菌制劑能夠增加印度白蝦的消化酶活性，提高其生產(chǎn)性能。 本研究枯草芽孢桿菌BL-Y9 在37 ℃液體搖瓶培養(yǎng)24 h，中性蛋白酶、 纖維素酶酶活分別為184.98、9.68 U/mL，均高于劉秀俠等（2017）報道的最高酶活產(chǎn)生菌BLLL-2，具有較好的產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶性能，且對三種不同飼料組合的消化效果較好， 其中以對玉米面+豆粕組合消化效果最好，經(jīng)作用后消化液粗纖維消化率、游離氨基酸增加幅度、可溶性氨基酸增加幅度、 還原糖增加幅度及酸溶蛋白增加幅度均明顯提高， 這充分說明枯草芽孢桿菌不僅能促進飼料底物的消化， 同時也能夠分解部分抗營養(yǎng)因子， 解除飼料原料本身所含抗營養(yǎng)因子的抑制作用。

3.3 枯草芽孢桿菌的安全性能 枯草芽孢桿菌是安全可靠（GRAS）菌種，目前其作為新型的飼料添加劑已成為研究熱點。 本研究對枯草芽孢桿菌BL-Y9 進行3 個不同劑量的小鼠安全性試驗，結(jié)果表明，經(jīng)口灌胃1 周不同劑量枯草芽孢桿菌菌懸液之后， 小鼠的活動和采食量沒有顯著變化，與空白組無顯著差異。 而且經(jīng)解剖后，不同劑量組小鼠的臟器指數(shù)均與空白組相比沒有顯著差異， 表明在供試劑量1 ～100 億/只內(nèi)對小鼠是安全的， 為菌株BL-Y9 在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持。

4 結(jié)論

枯草芽孢桿菌BL-Y9 對豬大腸桿菌K88、雞大腸桿菌O78、 雞白痢沙門氏菌CV33533 及金黃色葡萄球菌C56011 有較好的體外抑菌效果； 發(fā)酵上清液中性蛋白酶及纖維素酶活性分別可達184.94、9.68 U/mL；經(jīng)模擬動物體消化道的試驗結(jié)果表明, 菌株BL-Y9 對三種不同飼料組合的消化效果較好，其中以對玉米面+豆粕組合消化效果最好。 動物試驗結(jié)果顯示，每只小鼠灌胃1 ～100 億劑量菌體對小鼠是安全的。