陳文寧， 鄭娟霞， 月金玲， 楊 莉， 王琤韋華

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330013）

海帶是我國一種高產(chǎn)的海藻類作物， 其含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、多糖類物質(zhì)等營養(yǎng)成分，其中海帶多糖是重要的功能性物質(zhì) （葉竹秋，2001）。 研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多種生理活性 （Chen 等，2010；Shuai 等，2010；Li 等，2008；Wang 等，2008；Athukorala 等，2007），是目前的研究熱點之一。 海帶多糖可用作動物生產(chǎn)中的飼料添加劑， 但商品海帶多糖的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高，因此，尋找一種簡單提取海帶粗多糖的方法， 可以推進(jìn)其在動物生產(chǎn)上的應(yīng)用。 本試驗通過檸檬酸提取法和堿提取法分別提取海帶粗多糖， 比較二者的多糖得率和抗氧化活性，為海帶多糖更好地應(yīng)用于畜牧業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗材料 干海帶購于江西省南昌市市場，粉碎待用。

1.1.2 試驗試劑 無水乙醇、濃硫酸、苯酚、檸檬酸、碳酸鈉、七水合硫酸亞鐵、過氧化氫、鹽酸、氯化鐵、 葡萄糖、 鄰菲咯啉、2，4，6-三吡啶基三嗪（TPTZ），均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 試驗儀器 本試驗所使用儀器規(guī)格見表1。

表1 試驗所需儀器

1.2 試驗方法

1.2.1 海帶多糖提取工藝流程

1.2.1.1 檸檬酸提取法工藝流程 本試驗參考盧茳虹等（2012）研究得到的試驗方法進(jìn)行提取，將干海帶粉碎，檸檬酸溶液（pH=2）浸取，抽濾，合并濾液，加入氫氧化鉀調(diào)節(jié)中性pH，濃縮，在4 ℃靜置8 h 進(jìn)行3 次醇沉（乙醇最終濃度為80%），再進(jìn)行抽濾得到沉淀物，用無水乙醇洗滌脫水，用干燥箱烘干得到海帶粗多糖。

1.2.1.2 堿提取法工藝流程 本試驗參考原澤知等（2010）研究得到的試驗方法進(jìn)行提取，將干海帶粉碎，5% Na2CO3溶液浸取，抽濾，合并濾液濃縮，在4 ℃靜置8 h 進(jìn)行3 次醇沉（乙醇最終濃度為80%），再進(jìn)行抽濾得到沉淀物，用無水乙醇洗滌脫水，用干燥箱烘干得到海帶粗多糖。

1.2.2 粗多糖提取率的計算 多糖含量測定采用苯酚-硫酸法（周德慶，1986）。 精密稱取烘干后的葡萄糖100 mg，加入適量水定容至1 L，配制成濃度為100 mg/L 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別吸取0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于試管中，用蒸餾水將溶液補(bǔ)至2 mL，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液，迅速加入濃硫酸5 mL，充分搖勻再靜置20 min， 在波長490 nm 下測定OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 各取酸提和堿提得到的海帶粗多糖樣品0.5 g，定容到100 mL，然后取稀釋溶液2 mL 加入測定管中，重復(fù)上述操作5 次。 空白管以超純水代替待測樣本， 依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算海帶粗多糖樣品的多糖得率。

多糖得率/%=提取液中多糖含量/所用海帶總量×100。

1.2.3 鐵還原抗氧化能力（FRAP）測定 準(zhǔn)確稱取七水合硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）0.0278 g，溶于超純水定容至1 L，配成濃度0.1 mol/L 的FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)母液。取FeSO4·7H2O 標(biāo)準(zhǔn)母液0.1 mL，用超純水稀釋至濃度為0.1 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液。 用0.1 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)工作液配制FeSO4溶液的濃度梯度， 包括濃度為0.01、0.03、0.05、0.07、0.1 mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液各0.2 mL，加入1.8 mL TPTZ 工作液，混勻，于37 ℃水浴保溫10 min，593 nm 測定吸光值， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 依據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算海帶多糖樣品總抗氧化能力，重復(fù)5 次。空白管以超純水代替待測樣本，其他相同。依據(jù)FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算海帶多糖樣品總抗氧化能力。 樣品的抗氧化能力以FRAP 值表示（1 FRAP=1 mmol/L FeSO4）。

1.2.4 羥自由基的清除能力 取1 mL 0.75 mmol/L的鄰菲咯啉溶液于試管中，分別加入2 mL 的pH

7.4 磷酸鹽緩沖液和1 mL 的純水， 充分混勻后，加0.75 mol/L 硫酸亞鐵1 mL 混勻， 加0.01%的過氧化氫1 mL， 于37 ℃恒溫水浴60 min，于536 nm 下分別測其吸光度（Ap）；再用30%的乙醇1 mL 代替1 mL 過氧化氫，測得吸光度（Ag）。將酸提和堿提得到的海帶粗多糖樣品配成1.0 mg/mL 的溶液， 取1 mL 代替1 mL 蒸餾水，測得吸光度（As），重復(fù)5 次。 羥自由基清除能力的計算公式為：

·OH 清除率/%=[（As-Ap）/（Ag-Ap）]×100。

1.3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)選用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0 進(jìn)行分析處理，采用多重比較的LSD 法檢驗不同提取方法下多糖得率和抗氧化活性的差異水平。 試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 海帶多糖的多糖得率 由表2 可知，檸檬酸提取法得到的粗多糖得率為（15.92±2.36）%，堿提取法得到的粗多糖得率為（6.05±0.81）%，二者之間的多糖得率差異顯著（P ＜0.05），經(jīng)檸檬酸提取法提取的粗多糖含量高于堿提取法。

表2 海帶多糖的多糖得率 %

2.2 海帶多糖的抗氧化能力 如表3 所示，檸檬酸提取法和堿提取法提取的粗海帶多糖的總抗氧化能力FRAP 值分別為0.048±0.004 和0.022±0.012， 且二者之間的多糖得率差異顯著（P ＜0.05），說明檸檬酸提取法提取的粗多糖總抗氧化能力強(qiáng)于堿提取法提取的粗多糖總抗氧化能力。

表3 海帶多糖的FRAP 值

2.3 海帶多糖的羥自由基清除率 如表4 所示，當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL 時， 酸提的海帶多糖對·OH 清除率為42.67%，堿提的海帶多糖對·OH 清除率為32.03%，說明海帶多糖對·OH 有一定清除能力，酸提的海帶多糖對·OH 的清除能力顯著高于堿提的海帶多糖。

表4 海帶多糖的羥自由基清除率%

3 討論

3.1 酸提和堿提的多糖得率 目前， 提取海帶多糖的常用方法有水提法、酶提法、酸提法、堿提法等， 使用水提法提取海帶多糖時可達(dá)10.49%（余華，2006）；使用酶提法可達(dá)11.62%；使用酸提法時可達(dá)35.10%（周裔杉，2006）； 使用堿提法時可達(dá)76.88%（劉秀河等，1999），由此表明，酸提取法和堿提取法的產(chǎn)率相對較高，故本試驗選擇堿提取法和酸提取法提取海帶多糖并對其多糖得率和抗氧化活性進(jìn)行比較。 結(jié)果表明，檸檬酸提取法得到的多糖得率為 （15.92±2.36）%， 這一結(jié)果與盧茳虹等（2012）提取得到的多糖得率[（13.19±0.06）%]差異不大。王智榮等（2016）研究了幾種常見的酸以及水等提取溶劑提取海帶多糖，確定了檸檬酸提取海帶多糖的效果最佳，多糖得率最高為12.95%，也與本試驗結(jié)果相近。而本試驗堿提取法提取到的多糖得率為（6.05±0.81）%，與原澤知等（2010）的海帶多糖產(chǎn)率2.13%存在差異， 可能由于所取海帶部位不同，海帶多糖含量有所差異。此外，閔玉濤（2015）比較了水提和醇提兩種方法提取海藻多糖的效果，分別為6.00%和7.80%；蔡彬新等（2012）用水提法提取海帶多糖，提取率達(dá)7.90%；張換等（2013）用纖維素酶提取海帶多糖的產(chǎn)率為11.62%； 任狀等（2018） 采用超聲波協(xié)同酶法提取的海帶多糖產(chǎn)率為19.40%。 上述方法的提取效果大多弱于檸檬酸提取法，強(qiáng)于或相近于堿提法。因此，檸檬酸提取法較堿提法具有更好提取效果。

3.2 海帶粗多糖的抗氧化力 自由基是機(jī)體代謝產(chǎn)生的一類氧化性極強(qiáng)的物質(zhì)，具有攻擊生物分子的功能，較高的氧化水平，會發(fā)生超氧化化學(xué)反應(yīng)，從而破壞細(xì)胞作用及其組織。多數(shù)自由基可以誘導(dǎo)DNA 及染色體結(jié)構(gòu)損壞、干擾細(xì)胞代謝、破壞蛋白質(zhì)活性和酶體系，可直接或間接引起慢性疾病及衰老效應(yīng)（魏夢濤等，2018）。 自由基易與還原性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，還原性越強(qiáng)的物質(zhì)越容易與自由基的強(qiáng)氧化性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，清除的自由基越多，其抗氧化活性也就越高，常用FRAP 法測定。 FRAP 值越大，多糖抗氧化能力越強(qiáng)。本試驗結(jié)果顯示，檸檬酸提法和堿提法的海帶粗多糖的還原力分別為（0.048±0.004）和（0.022±0.012）。葉文斌等（2016）提取拐棗多糖， 其濃度為2.0 mg/mL 時，F(xiàn)RAP 值為0.94；李秋瑩等（2016）研究四種淫羊藿多糖的抗氧化活性，F(xiàn)RAP 值分別為0.166、0.411、0.237、0.236。本試驗的結(jié)果與此相比，檸檬酸提法和堿提法的海帶粗多糖的還原力較弱，但檸檬酸提取法的還原力比堿提法的效果好。

3.3 海帶粗多糖的·OH 清除率 ·OH 是機(jī)體在新陳代謝中由過氧化氫釋放出的破壞性強(qiáng)、 危害較大的一種自由基，其可以直接與糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)和磷脂等生物大分子物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)， 導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷和細(xì)胞大面積凋亡（Xu 等，2011；Shen等，2001），也可以通過氧化堿基，使細(xì)胞DNA 結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)胞壞死或突變（樊岫珊，2017）。 因此，清除體內(nèi)代謝產(chǎn)生的過多累積的自由基，有助于維持細(xì)胞活性和氧化代謝平衡 （樓蘭花等，2003）。 本試驗結(jié)果顯示，當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時，檸檬酸提法提取的海帶粗多糖的·OH 清除率為42.67%，堿提法提取的海帶粗多糖的·OH 清除率為32.03%，而賈彥明等（2010）通過堿提取法分離純化得到海帶多糖的多糖濃度為2 mg/mL 時，·OH 清除率為46%， 說明檸檬酸提法和堿提取得到的粗多糖具有一定的抗氧化活性， 都能有效清除·OH。 魏碧娜（2016）提取的海帶粗多糖濃度為1 mg/mL 時·OH 清除率為43%， 與本試驗酸提的結(jié)果相近。 因此，兩種提取方法相比較，檸檬酸提取法提取得到的海帶多糖的·OH 清除率強(qiáng)于堿提取得到的海帶多糖。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，檸檬酸提取法提取海帶多糖和其抗氧化活性均優(yōu)于堿提取法。 因此，檸檬酸提取法更適合于工業(yè)生產(chǎn)粗多糖，降低養(yǎng)殖成本。