黃 慧，樊國(guó)燕，彭志鋒，婁 飛，王曉琳，裴亞玲，胡功政

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 河南 鄭州 450046； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 河南 鄭州 450046)

細(xì)菌生物被膜(biofilm，BF)的形成是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物耐藥以及造成臨床不同程度慢性或持續(xù)性細(xì)菌感染的關(guān)鍵因素[1]。沙門菌是引起人類食源性疾病的主要病原菌，生物被膜的形成與沙門菌病的爆發(fā)和患者的持續(xù)感染密切相關(guān)[2-4]。因此，抑制或減弱其生物被膜的形成，能有效降低其致病性，可成為臨床防治沙門菌病的重要手段。

生物被膜的形成和消解過(guò)程存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，有報(bào)道稱多種雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-compontent signal transduction system，TCS)，如OmpR/EnvZ、RcsBCD、PvrRS、PprAB、CpxAR等，參與調(diào)控生物被膜的形成[5]，但其具體調(diào)控機(jī)制還未被完全闡明。CpxAR系統(tǒng)是革蘭陰性菌中普遍存在的一種TCS，主要參與細(xì)菌膜壓力變化的調(diào)控，由感應(yīng)子激酶CpxA和應(yīng)答調(diào)節(jié)子cpxR組成，cpxR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，調(diào)控靶基因表達(dá)、幫助細(xì)菌應(yīng)對(duì)環(huán)境變化[6]。CpxAR系統(tǒng)被證實(shí)對(duì)大腸桿菌和胸膜肺炎放線桿菌等細(xì)菌生物被膜的形成具有重要調(diào)控作用[7-9]，而其在沙門菌生物被膜形成過(guò)程中發(fā)揮怎樣的作用，目前還未被闡明。研究旨在通過(guò)用結(jié)晶紫染色法測(cè)定鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離菌株在cpxR基因缺失前后生物被膜形成量的變化，以分析cpxR基因?qū)κ髠抽T菌生物被膜形成能力的影響，能為進(jìn)一步研究CpxAR系統(tǒng)對(duì)沙門菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制以及闡明沙門菌生物被膜形成過(guò)程中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)，能為臨床防治沙門菌病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)株CVCC541(以下簡(jiǎn)寫為JS)為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送；6株臨床分離菌(編號(hào)分別為SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH7)經(jīng)鑒定為鼠傷寒沙門菌；以上各菌株的cpxR基因缺失菌株(分別命名為JSΔcpxR、SH1ΔcpxR、SH2ΔcpxR、SH3ΔcpxR、SH4ΔcpxR、SH5ΔcpxR、SH7ΔcpxR)，為前期研究中通過(guò)Red同源重組技術(shù)和噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)制備所得[10]。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB肉湯、SS瓊脂培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑

2×Taq PCR Mastermix，購(gòu)自TAKARA公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100～2000 bp)，購(gòu)自Sangon Biotech公司；瓊脂糖購(gòu)自TIANGEN公司；丙三醇、冰乙酸為天津市永大化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；結(jié)晶紫、草酸銨為天津市瑞金特化學(xué)品有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的復(fù)蘇

取甘油菌種，按1∶100比例無(wú)菌接種于LB肉湯中，37 ℃震蕩培養(yǎng)16 h，用接種環(huán)無(wú)菌挑取一環(huán)菌液，劃線接種于SS瓊脂平板上，37 ℃溫箱倒置培養(yǎng)12 h，然后釣取1-2個(gè)典型菌落接種于LB肉湯，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h備用。

1.2.2 菌株cpxR基因的鑒定

(1)引物合成

引物序列參考前期研究中的cpxR基因擴(kuò)增引物Cr-F/Cr-R[11]，委托華大基因公司合成，引物序列具體信息如表1。

(2)PCR擴(kuò)增

取1.2.1中復(fù)蘇培養(yǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物，煮沸10 min，12000 r/min 離心3 min，取上清液。利用前期研究中設(shè)計(jì)的cpxR基因擴(kuò)增引物Cr-F/Cr-R，以煮沸離心得到的上清液為模板，對(duì)研究中選取的cpxR基因缺失株進(jìn)行PCR鑒定，確證所選取菌株cpxR基因的存在或失活。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：DNA模板1 μL，DNA聚合酶(2×Taq PCR Mastermix)12.5 μL，上游引物Cr-F(10 μmol/L)1 μL，下游引物Cr-R(10 μmol/L)1 μL，滅菌純化水9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后鑒定。

表1 cpxR基因鑒定引物

1.2.3 生物被膜形成能力測(cè)定

(1)1%草酸銨結(jié)晶紫染液的配制

取結(jié)晶紫2 g、 95%乙醇20 mL混合制成溶液A(結(jié)晶紫乙醇飽和液20 mL)，再取草酸銨0.8 g、蒸餾水80 mL混合制成溶液B(1%草酸銨水溶液80 mL)，然后將溶液A與溶液B混合，用濾紙過(guò)濾即得。

(2)96孔微量板定量檢測(cè)生物被膜

將1.2.2中鑒定后的菌株轉(zhuǎn)TSA平板37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單個(gè)菌落于TSB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，以麥?zhǔn)媳葷岱▽⒕合♂屩良s麥?zhǔn)媳葷岫群螅肨SB肉湯將菌液稀釋至1.0×107CFU/mL，然后以每孔100 μL加到滅菌的96孔微量培養(yǎng)板，置于37 ℃恒溫箱中孵育24 h，每組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白培養(yǎng)液組，作為陰性對(duì)照。次日，小心吸取培養(yǎng)液，用蒸餾水輕柔沖洗兩次，置通風(fēng)陰涼處倒置風(fēng)干固定。然后用每孔120 μL的1%的結(jié)晶紫溶液染色15-20 min后，以流水沖洗至空白染色孔未見(jiàn)明顯顏色，再置通風(fēng)處。風(fēng)干后向每孔加入150 μL的33%的冰醋酸溶液，充分溶解染色液10 min。而后放置酶標(biāo)儀中，讀取波長(zhǎng)為570 nm處的OD值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

以O(shè)Dc值(ODc等于空白孔的平均OD值加上其3倍標(biāo)準(zhǔn)差而得到的OD值)為界限值，將菌株分為：不成膜株(OD≤ODc)(-)；弱成膜能力株(ODc4ODc)(+++)。

采用t檢驗(yàn)的方法，對(duì)cpxR基因缺失前后測(cè)得菌株OD570值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，根據(jù)p值判斷cpxR基因缺失前后菌株生物被膜形成量的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株cpxR基因的鑒定

將菌株進(jìn)行cpxR基因的PCR擴(kuò)增后，電泳結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，所有親本菌(JS、SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH7)PCR擴(kuò)增后均得到分子量為854 bp的條帶，而cpxR基因缺失株(JSΔcpxR、SH1ΔcpxR、SH2ΔcpxR、SH3ΔcpxR、SH4ΔcpxR、SH5ΔcpxR、SH7ΔcpxR)擴(kuò)增后均得到分子量為1 632 bp的條帶，原因是cpxR基因缺失株是抗性基因替換掉cpxR基因所得。此結(jié)果與預(yù)期一致，說(shuō)明所選菌株為親本菌和cpxR基因缺失菌。

M：DNA Marker 2000；1、3、5、7、9、11、13分別為親本菌JS、SH1、SH2、SH3、SH4、SH5、SH7；2、4、6、8、10、12、14分別為cpxR基因缺失株JSΔcpxR、SH1ΔcpxR、SH2ΔcpxR、SH3ΔcpxR、SH4ΔcpxR、SH5ΔcpxR、SH7ΔcpxR

2.2 菌株生物被膜形成能力測(cè)定結(jié)果

根據(jù)空白對(duì)照孔的平均OD值，計(jì)算得到ODc、2ODc和4ODc值分別為0.0600、0.1314和0.2628。將各菌株OD值與ODc、2ODc和4ODc值比較判定出各菌株的生物被膜形成能力(表2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)菌株JS為中等成膜能力株，在cpxR缺失后(JSΔcpxR)成為弱成膜能力株；6株臨床分離的鼠傷寒沙門菌中，SH2、SH4、SH5、SH7為強(qiáng)成膜能力菌株，cpxR基因缺失后，SH2ΔcpxR和SH4ΔcpxR為中等成膜能力菌株，SH7ΔcpxR成為弱成膜能力菌株，SH5ΔcpxR仍為強(qiáng)成膜能力菌株；SH1為中等成膜能力菌株，cpxR基因缺失后(SH1ΔcpxR)成為弱成膜能力菌株；SH3為弱成膜能力菌株，cpxR基因缺失后(SH3ΔcpxR)仍為弱成膜能力菌株。

表2 各菌株生物被膜形成能力測(cè)定結(jié)果

通過(guò)對(duì)cpxR基因缺失前后菌株生物被膜形成量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(圖2)，發(fā)現(xiàn)7株鼠傷寒沙門菌在cpxR基因缺失后生物被膜形成量均有所降低，其中有2株(SH3和SH7)在cpxR缺失后生物被膜形成量降低極顯著(p<0.01)，3株(JS、SH2和SH4)在cpxR缺失后生物被膜形成量降低顯著(p<0.05)。結(jié)果表明，cpxR基因缺失可使鼠傷寒沙門菌生物被膜形成能力明顯降低。

圖2 各菌株在cpxR缺失前后生物被膜形成量的差異性分析

3 結(jié)論與討論

沙門菌在自然環(huán)境中多數(shù)是以生物被膜形態(tài)存在的，生物被膜的形成是其耐藥性和致病性增強(qiáng)的關(guān)鍵因素[12]。目前發(fā)現(xiàn)沙門菌中主要存在9種 TCS，其中CpxAR系統(tǒng)是對(duì)多種革蘭陰性細(xì)菌的致病性和耐藥性有調(diào)控作用的 TCS 之一[13，14]，而弄清CpxAR系統(tǒng)與沙門菌生物被膜形成之間的關(guān)系，對(duì)揭示沙門菌耐藥性和致病性形成的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。研究通過(guò)分析鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株在cpxR基因缺失前后的生物膜形成情況，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床分離株在cpxR基因缺失后，生物被膜形成能力明顯降低。前期關(guān)于cpxR對(duì)鼠傷寒沙門菌致病性和耐藥性調(diào)控作用的研究表明，cpxR基因缺失后鼠傷寒沙門菌對(duì)多種抗菌藥物的敏感性增強(qiáng)[10]，而其黏附和侵襲PK-15細(xì)胞能力下降[14,15]。聯(lián)合研究結(jié)果知道，cpxR是沙門菌致病性、耐藥性和生物被膜形成的核心調(diào)控元件，是極具潛力的抗菌作用靶點(diǎn)。細(xì)菌中不同TCS之間往往存在著復(fù)雜的交聯(lián)作用，欲以CpxAR系統(tǒng)為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物，還需深入探討其中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，闡明CpxAR系統(tǒng)介導(dǎo)的生物被膜形成的分子機(jī)制。研究為進(jìn)一步研究沙門菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制探明了方向，為闡明沙門菌生物被膜形成的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為將來(lái)更好的防控鼠傷寒沙門氏菌的暴發(fā)和流行提供了參考依據(jù)。