宮甜甜，黃少剛，孫瑞珍，申景嶺，李秋明，雷 蕾，單智焱

1 哈爾濱醫(yī)科大學 組織學與胚胎學教研室， 哈爾濱150081；2 哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū) 組織學與胚胎學教研室， 黑龍江 大慶163319

肝祖細胞(hepatic-like progenitor cells,HPCs)在肝再生中發(fā)揮重要作用。HPCs的微環(huán)境是由細胞、細胞外基質(zhì)成分以及這些細胞所釋放的生長因子和細胞因子組成的特殊微環(huán)境，這種特殊的微環(huán)境和不同成分間的相互作用影響HPCs的增殖和分化[1-2]。肝巨噬細胞具有吞噬異物、傳遞抗原、清除衰老細胞、參與免疫等作用，是構成肝組織微環(huán)境最重要的細胞之一；在肝損傷過程中，巨噬細胞可直接參與肝祖細胞的激活，促進肝損傷修復。研究[3]顯示，巨噬細胞對不同類型的干細胞也具有調(diào)控作用。巨噬細胞與造血干細胞共培養(yǎng)，能促進紅系細胞的分化。巨噬細胞還能促進骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨細胞分化[4]。本研究探討了巨噬細胞對小鼠誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)向HPCs分化的影響，為闡明HPCs發(fā)育的微環(huán)境作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞系 8～12周齡C57BL/6N(雌鼠)24只購自維通利華實驗動物技術有限公司；實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2016-0006，使用許可證編號：No.110011200107063283；體外誘導小鼠iPSCs細胞系(C1細胞)，為實驗室凍存。

1.2 主要試劑 DMEM/F12、Neurobasal培養(yǎng)基、KO血清替代物(KOSR)、雙抗(P/S)、非必需氨基酸(NEAA)、谷氨酰胺(L-Glu)、N2、B27、丙酮酸鈉(Na-Pyr)、β-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol)等試劑均為美國Gibco公司，DPBS、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶明膠等均為美國SIGMA公司。

1.3 HPCs的建立過程及向肝細胞分化 將C1細胞接種在明膠上，培養(yǎng)液為ESM(高糖DMEM)，15% ES級別胎牛血清(ES-FBS)，100 U/L P/S，1%NEAA，2 mmol/L L-Glu，1 mmol/L Na-pyr，1000 U/L白血病抑制因子(LIF)，0.1 mmol/L β-巰基乙醇。生長3 d后，將培養(yǎng)液更換為添加10 ng/ml-骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bmp4)和LIF的CDM培養(yǎng)液(DMEM/F12，Neurobasal培養(yǎng)基，5%ES-FBS，1%P/S，1% L-Glu，0.5× N2，0.5 ×B27)。2 d后，將C1細胞消化，以2×105個細胞/孔接種在Ⅰ型膠原包被的6孔板上，培養(yǎng)液更換為添加20 ng/ml 激活素A(ActivinA)和1 mmol/L丁酸鈉(NaB)的CDM培養(yǎng)液(此時記為誘導第1天，D1)，培養(yǎng)2 d。D3，去除NaB，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。D5，將細胞消化，重新接種在明膠包被的6孔板上，用添加20 ng/ml ActivinA，20 ng/ml Bmp4和20 ng/ml 成纖維細胞生長因子(FGF)的CDM培養(yǎng)液培養(yǎng)。D7，將培養(yǎng)液更換為HPCs培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)至D12。HPCs向肝細胞分化，將iPSCs-HPCs以5×105/孔接種在 Ⅰ 型膠原包被的6孔板上，無血清的CDM培養(yǎng)液添加10 ng/ml表皮生長因子(EGF)，10 ng/ml人類生長因子(HGF)，10 ng/ml抑瘤素 OCM，1% 二甲基亞砜(DMSO)，10-7mol/L地塞米松，培養(yǎng)6 d。

1.4 巨噬細胞的獲取 采用腹腔沖洗法獲得小鼠的巨噬細胞，在收集C57B/6N小鼠巨噬細胞的前3天，每只小鼠腹腔注射3 ml 硫膠脂注射夜。3 d后，斷頸處死小鼠，腹部向上放置于泡沫板上；用剪刀和鑷子切開覆膜的外側皮膚，使其暴露內(nèi)層腹膜皮膚；用5 ml注射器抽取含3%FBS的PBS 5 ml注入小鼠的腹腔內(nèi)，輕輕按摩腹部，沖洗腹腔內(nèi)部的巨噬細胞；再用注射器將沖洗液吸出，注意避開脾臟和腸道，避免脂肪組織或其他組織堵塞。收集到的液體應為含有巨噬細胞白色細胞懸液，立即放入冰盒上的離心管內(nèi)；重復沖洗3次后，在腹膜內(nèi)皮上做一個切口，用鑷子揭開皮膚，用膠頭吸管吸取腹腔內(nèi)剩余的液體。如果收集到的細胞懸液有明顯的血液污染，那么收集到的樣品應該棄掉。1000 r/min離心5 min后，即可獲得來源于小鼠腹腔的巨噬細胞。將巨噬細胞以1×106個/孔接種于6孔板內(nèi)，更換CDM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，收上清即為Mc-CDM。將HPCs的誘導分為兩組進行，一組使用正常培養(yǎng)基，為對照組(Ctrl組)；另一組在HPCs誘導D5使用Mc-CDM培養(yǎng)基，為實驗組(Mc組)。

1.5 免疫熒光染色 iPSCs-HPCs接種于玻片培養(yǎng)48 h后，經(jīng)PBS洗滌5 min/次，洗滌2次，4%PFA固定>30 min，PBS-T(PBS+0.25%Tritonx-110)洗滌5 min/次,洗滌3次;70%乙醇洗滌5 min，PBS-T洗滌5 min，封閉液(PBS-T+2%BSA)加入一抗避光室溫孵育2 h；PBS-T洗滌5 min/次,洗滌3次，二抗避光室溫孵育1 h；PBS-T洗滌5 min/次,洗滌3次；Hoechest 33342 染核，20 s；PBS-T 洗滌5 min；封片后熒光顯微鏡拍照。

1.6 PAS染色 HPCs接種于鋪有蓋玻片的6孔板，向肝細胞誘導分化至D6，經(jīng)PBS洗滌5 min/次,洗滌2次，4%PFA固定>30 min，用PBS洗滌5 min/次,洗滌2次，高碘酸處理，去離子水洗滌10 min/次,洗滌2次，schiff染液10 min，去離子水洗滌10 min/次,洗滌 2次，Mayer蘇木素復染15～30 s，去離子水洗滌10 min/次,洗滌2次，脫水，中性樹脂封片。

1.7 Western Blot 將樣品及Maker按順序加入泳道，電泳、轉膜，5 %脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗，于4 ℃冰上孵育過夜。用 PBST洗去未結合的一抗，10 min/次，洗滌3次；加入二抗室溫孵育1 h；用PBST洗去未結合的二抗，10 min/次，洗滌3次；避光配制ECL工作液，滴加在PVDF膜上，顯影。

1.8 倫理學審查 本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學大慶校區(qū)倫理委員會審批，批號：HMUDQ2020102201，符合實驗室動物管理與使用準則。

2 結果

2.1 iPSCs-HPCs的建立 將小鼠iPSCs細胞系C1向HPCs誘導，誘導流程見圖1a。形態(tài)學上可見，C1在明膠上呈單層細胞生長。加入NaB后, C1增殖能力降低，大量細胞出現(xiàn)凋亡。去除NaB后, D5細胞開始增殖，呈扁平克隆狀生長。D8細胞開始鋪路石狀生長，且增殖旺盛；D12大部分細胞均為鋪路石樣，并呈圓形攤開生長(圖1b)。收集誘導D12的細胞，進行免疫熒光染色，可見誘導D12細胞高表達肝祖細胞相關基因CK19和ICAM(圖1c)。上述結果表明成功獲得了iPSCs-HPCs。

注：a，HPCs誘導流程圖；b，細胞各個誘導階段的形態(tài)圖(×10)；c，免疫熒光染色檢測誘導D12細胞中CK19 及ICAM的表達(×20)。圖1 iPSCs-HPCs的建立

2.2 iPSCs-HPCs可分化為有功能的肝細胞 形態(tài)學上可見，與接種后D0相比，從誘導D2開始逐漸向肝細胞的形態(tài)轉變，細胞體積逐漸增大，從圓形或橢圓形逐步變?yōu)槎噙呅巍ＵT導D6可見細胞中央出現(xiàn)較大的細胞核，有的細胞出現(xiàn)雙核結構，具有典型的肝細胞形態(tài)(圖2a)。取誘導D6細胞進行免疫熒光檢測，結果顯示這些細胞表達肝細胞特異標志物Alb(圖2b)；PAS染色可見細胞出現(xiàn)紫紅色沉淀，說明誘導D6細胞可合成糖原，這些細胞具有肝細胞合成肝糖原的功能(圖2c)。以上結果說明iPSCs-HPCs具有分化為肝細胞的潛能，且這些肝細胞具有合成糖厚的功能。

2.3 巨噬細胞促進iPSCs-HPCs形成 巨噬細胞形態(tài)及免疫熒光檢測(圖3a)結果顯示，巨噬細胞表達其特異性基因F4/80。形態(tài)學上(圖3b)，與Ctrl組相比，D8 Mc、D12 Mc組細胞形態(tài)相似，均為鋪路石樣扁平細胞，可見巨噬細胞對HPCs形態(tài)學無明顯影響。免疫熒光染色顯示，與D12 Ctrl組相比，D12 Mc組的肝祖細胞特異性蛋白CK19的表達顯著增高(0.901±0.072 vs 0.686±0.097，t=-3.093，P<0.05)(圖3c、d)。

2.4 巨噬細胞通過自噬提高iPSCs-HPCs功能 Western Blot結果與免疫熒光檢測結果一致，與D12 Ctrl組相比，D12 Mc組肝祖細胞相關基因CK19的表達顯著增高(1.922±0.103 vs 1.448±0.012，t=-7.881，P<0.05)；同時，D12 Mc組自噬相關基因LC3的表達高于D12 Ctrl組，差異有統(tǒng)計學意義(1.392±0.042 vs 1.101±0.048，t=-5.978，P<0.05)(圖4)。以上結果說明，巨噬細胞對iPSCs-HPCs的形成起到促進作用，其作用機制可能與巨噬細胞調(diào)控iPSCs-HPCs自噬水平升高有關。

圖4 兩組CK19和LC3的表達水平比較

3 討論

HPCs在鼠中亦被稱為肝卵圓細胞。在正常成體肝臟中比例很小，以休眠干細胞的狀態(tài)主要存在于赫氏小管(Hering管)和膽管樹終末處。在成熟肝細胞的再生能力嚴重受損的情況下，它們開始大量增殖，從終末膽管區(qū)向肝板滲透，并向肝細胞和膽管上皮細胞分化，從而在肝再生中發(fā)揮重要作用。為了在體外成功獲取穩(wěn)定的，且在形態(tài)、結構和功能上與體內(nèi)發(fā)育更接近的肝祖細胞，Zhou等[5]通過添加誘導因子，利用4步法，獲取了小鼠胚胎干細胞來源的肝祖細胞及肝細胞；Yanagida等[6]利用三維生物構建技術成功的獲得了人誘導多能性干細胞來源的HPCs。 這些生長因子、轉錄因子、microRNAs及小分子物質(zhì)等對HPCs的形成、增殖和分化至關重要，而存在于干細胞周圍的各類細胞和細胞外基質(zhì)的相互作用更是控制干細胞的行為和干細胞之間平衡的關鍵因素。

在肝組織內(nèi)，定居著大量的肝巨噬細胞。肝巨噬細胞有強大的吞噬、吞飲能力，可清除機體的病原微生物、異物及衰老細胞；能殺傷腫瘤細胞，處理、傳遞抗原，參與免疫應答，在維持肝組織內(nèi)的微環(huán)境等方面起著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞能夠促進HPCs的形成。在成體肝臟內(nèi)，巨噬細胞參與維持HPCs靜息狀態(tài)表型，抑制其分化；在慢性炎癥時，巨噬細胞分泌相關細胞因子促進HPCs的激活[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在iPSCs向HPCs分化過程中，巨噬細胞可能通過調(diào)控自噬，影響HPCs的形成，提高自噬促進iPSCs向HPCs分化。這與Chen等[8]的研究一致，自噬缺乏可導致HPCs干細胞特性缺失。HPCs可能通過增加自噬水平維持其自我更新和增殖能力。此外，研究[9]表明，自噬相關基因Atg7缺陷的血干細胞表現(xiàn)出線粒體損傷積累、活性氧水平升高和DNA損傷。在骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化的早期，通過抑制mTOR的負調(diào)控激活自噬，可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化[10]。這些研究表明，自噬在促進和維持成體干細胞的形成、自我更新和衰老中起著至關重要的作用[11]，而通過干細胞微環(huán)境中的巨噬細胞進行成體干細胞自噬的調(diào)控可能成為研究成體干細胞增殖分化的新方向。

肝臟非實質(zhì)細胞，如巨噬細胞、間質(zhì)、血管內(nèi)皮細胞等可直接影響肝臟實質(zhì)細胞的存活及肝功能。本研究初步驗證了巨噬細胞對iPSCs-HPCs的形成起到促進作用，其作用機制可能與巨噬細胞調(diào)控iPSCs-HPCs自噬水平升高有關。本研究采用巨噬細胞條件培養(yǎng)基的方式，實現(xiàn)了巨噬細胞的參與，但在空間上并沒有實現(xiàn)細胞之間的接觸，在今后的工作中，擬建立巨噬細胞三維共培養(yǎng)模式，實現(xiàn)細胞間的接觸，深入探討巨噬細胞促進HPCs形成的影響機制，為干細胞的體外誘導提供新的思路。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：宮甜甜、雷蕾、單智焱負責課題設計，資料分析，撰寫論文；黃少剛、申景嶺參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；孫瑞珍、李秋明負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。