趙雪艷 李思鋒 柏國(guó)清 李為民

（陜西省西安植物園，陜西省植物研究所，陜西省植物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心，西安 710061）

百合屬（Lilium）是百合科（Liliaceae）百合族（Lilieae）中一個(gè)具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和系統(tǒng)發(fā)育研究意義的屬。百合是多年生的球根類草本植物，許多百合種和品種花姿百態(tài)、芳香怡人、花色豐富，是世界上十大切花之一，也是盆栽、園林綠化和點(diǎn)綴庭院的名貴花卉［1］，有關(guān)花發(fā)育相關(guān)基因的研究具有重要的意義。另外，百合中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、淀粉、葡甘露聚糖和膳食纖維等，同時(shí)也含有多種生物活性化合物，可食用有的種亦可藥用，具有較好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和發(fā)開(kāi)前景［2］。

全球百合屬植物大約有110種，我國(guó)野生百合資源最為豐富，是百合屬植物的分布中心之一，約有55 種18 變種，其中35 種15 變種為我國(guó)特有種。細(xì)葉百合（L.pumilium）又名山丹，其花下垂，花被片反卷，無(wú)斑點(diǎn)或有少數(shù)，花朵嬌艷，是著名的野生藥用植物，并具極高的觀賞價(jià)值，是重要的觀賞性花卉。細(xì)葉百合在寒冷的條件下可以越冬，是百合抗性育種的重要親本［3］。中國(guó)藥典規(guī)定藥材百合的來(lái)源為百合科百合屬植物百合（L. brownii var.viridulum）或細(xì)葉百合的肉質(zhì)鱗葉。具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺，清心安神的功效。主治陰虛燥咳，勞嗽咳血，陰虛有熱之失眠心悸及百合病心肺陰虛內(nèi)熱證［4］。然而，張衛(wèi)等通過(guò)系統(tǒng)的本草考證研究認(rèn)為百合科植物野百合（L.brownie）及其變種百合為中國(guó)古代藥用百合的正品［5］。卷丹（L.lancifolium）是我國(guó)藥食兼用百合品種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗病和耐寒等優(yōu)勢(shì)，可在百合病害高發(fā)地區(qū)推廣種植［6］。川百合（L. davidii）花色艷麗，橙黃色且有紫黑色斑點(diǎn)，花被片極度反卷，其鱗莖可食用，具有優(yōu)良的觀賞價(jià)值和較好的食用價(jià)值，并且其抗病性強(qiáng)，是良好的抗性育種材料［7］。野百合是我國(guó)特有種，花型大而美麗，較好的抗逆性與觀賞利用價(jià)值。本團(tuán)隊(duì)前期采用高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)對(duì)野百合進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)過(guò)組裝共獲得47 605個(gè)unigenes。

不同物種之間的比較轉(zhuǎn)錄組研究可以用于快速進(jìn)化基因以及適應(yīng)性相關(guān)基因的研究。Ai等對(duì)11 種報(bào)春苣苔屬植物進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，研究了11 種報(bào)春苣苔屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化、親緣關(guān)系及適應(yīng)性相關(guān)基因［8］。并且對(duì)牛耳朵和黃花牛耳朵的比較轉(zhuǎn)錄組分析，研究?jī)蓚€(gè)物種在巖溶環(huán)境中的分子適應(yīng)機(jī)制，尋找出與巖溶環(huán)境適應(yīng)有關(guān)的19 對(duì)功能基因［9］。趙建花通過(guò)對(duì)地黃屬5 個(gè)種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析研究地黃屬植物5 個(gè)物種間的系統(tǒng)親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二倍體裂葉地黃處在地黃屬的基部，二倍體天目地黃和湖北地黃構(gòu)成姐妹類群，四倍體地黃和茄葉地黃聚成姐妹類群［10］。目前，對(duì)百合屬植物的研究主要集中在品種培育、繁殖技術(shù)、栽培、化學(xué)成分以及資源保護(hù)方面。目前只有少數(shù)關(guān)于百合遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究［11～13］。傳統(tǒng)的分類學(xué)研究方法很難解決百合屬物種間的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題，揭示百合屬物種在進(jìn)化過(guò)程中基因組結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化、種間基因流的變化規(guī)律、潛在的選擇作用等需要基因組層面的研究。本文通過(guò)對(duì)秦嶺地區(qū)的百合屬4個(gè)物種（細(xì)葉百合、川百合、卷丹和百合）的花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析花發(fā)育相關(guān)基因。并結(jié)合本團(tuán)隊(duì)前期的野百合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析篩選5種百合屬植物的直系同源基因及正選擇壓力相關(guān)基因，并利用獲取的直系同源基因構(gòu)建百合屬物種的進(jìn)化關(guān)系，為進(jìn)一步研究百合花的發(fā)育和調(diào)控以及百合屬植物進(jìn)化提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在陜西朱雀國(guó)家森林公園采集4種百合屬（細(xì)葉百合L.pumilum；川百合L.davidii；卷丹L.lanci?folium；百合L. brownii var. viridulum）健康植株的花。迅速放入液氮中速凍，隨后放在-80℃冰箱中保存。

1.2 RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采用Trizol 法提取細(xì)葉百合、川百合、卷丹和百合花中的總RNA。經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。然后將mRNA 分裂成短片段，并反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，隨后合成另一條鏈，從而純化得到的雙鏈cDNA。進(jìn)而修復(fù)雙鏈cDNA 的末端并在其末端加上poly（A）尾巴并連接Illumina 測(cè)序接頭。制備測(cè)序文庫(kù)。委托廣州基迪奧生物技術(shù)公司采用Illumina 雙端測(cè)序平臺(tái)對(duì)4 種百合屬植物的花器官進(jìn)行測(cè)序。將獲得的原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后得到高質(zhì)量的讀序，用Trinity和TGICL 按照默認(rèn)參數(shù)對(duì)得到的高質(zhì)量讀序進(jìn)行從頭組裝，得到unigene。

1.3 百合屬5種植物的unigenes的功能注釋和花發(fā)育相關(guān)基因的鑒定

為獲得4 種百合屬植物花的unigene 功能信息，將測(cè)序得到的unigene 與公共數(shù)據(jù)庫(kù)（Nr、Swiss-Prot、KOG、GO、KEGG）進(jìn)行相似性比對(duì)以獲得其基因功能。隨后結(jié)合野百合的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)百合屬5 種植物（野百合、細(xì)葉百合、川百合、卷丹和百合）unigene的功能注釋結(jié)果進(jìn)行比較，并且分析花發(fā)育相關(guān)基因。

1.4 直系同源基因的篩選和分析

首先使用transdecoder 軟件預(yù)測(cè)各物種Unige?ne 中的CDS 區(qū)域，然后利用OrthoMCL 對(duì)預(yù)測(cè)所得的5 種百合屬植物的CDS 序列進(jìn)行直系同源基因搜索，從中篩選出一對(duì)一的直系同源基因［14］。然后用paml-codeml 計(jì)算直系同源基因的非同義替換（Ka），同義替換率（Ks）值，并計(jì)算Ka/Ks 值［15］，進(jìn)而篩選出受正選擇作用的基因。

1.5 正選擇基因的富集分析

利用GOseq［16］的GO 基因富集方法對(duì)受到正選擇的直系同源基因（Ka/Ks>1）進(jìn)行基因分類富集。另外，對(duì)受到正向選擇的直系同源基因進(jìn)行Pathway 富集分析［17］，尋找受到正向選擇的直系同源基因相對(duì)于所有注釋的基因顯著富集的pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合屬4種植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝分析

采用Illumina HiSeq 2500測(cè)序技術(shù)對(duì)百合屬4種植物（細(xì)葉百合L.pumilum；川百合L.davidii；卷丹L. lancifolium；百合L. brownii var. viridulum）的花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。獲得的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)已上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA編號(hào)：SRP253797）。

使用Trinity 軟件對(duì)所有reads 進(jìn)行組裝，其中，在細(xì)葉百合中共獲得44 565個(gè)unigene，序列平均長(zhǎng)度為701 bp；在川百合中共獲得51 413 個(gè)unigene，序列平均長(zhǎng)度為719 bp；在卷丹中共獲得41 638個(gè)unigene，序列平均長(zhǎng)度為688 bp；在百合中共獲得44 716個(gè)unigene，序列平均長(zhǎng)度為737 bp（見(jiàn)表1）。細(xì)葉百合、川百合、卷丹、百合組裝的unigene的N50長(zhǎng)度分別為1 066、1 149、1 017和1 183 bp。

2.2 百合屬5種植物unigene的功能注釋

為了獲得本研究中4 種百合屬植物花的基因功能信息，分別將4 個(gè)物種獲得unigene 序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)（GO、Nr、Swiss-Prot、KOG、KEGG）進(jìn)行比對(duì)（E 值<1E-5）以及基因的功能注釋。5 種植物的unigene在上述公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋結(jié)果顯示細(xì)葉百合、川百合、卷丹和百合中能夠得到注釋的基因的百分比為分別為55.23%、61.54%、56.96% 和48.93%（見(jiàn)表2）。沒(méi)有匹配到的基因比較多，這可能是由于目前百合屬植物沒(méi)有基因組信息。

表1 百合屬4種植物的測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)信息Table 1 Statistical information for transcriptome sequencing of four species of Lilium

表2 百合屬5種植物轉(zhuǎn)錄組注釋信息Table 2 Annotation information of five species of Lilium

GO 注釋結(jié)果顯示細(xì)葉百合、川百合、卷丹和百合分別有6 785、7 398、6 475以及7 360條unige?ne序列得到注釋結(jié)果。GO注釋的結(jié)果主要分為3大類：生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能。結(jié)果顯示4種植物轉(zhuǎn)錄組的GO注釋結(jié)果相似。在生物過(guò)程功能類別中代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程組分中注釋的基因數(shù)目最多；在細(xì)胞組分類別中，注釋最多的基因歸類到細(xì)胞和細(xì)胞組分類別中；而在分子功能類別中，注釋最多的功能類別是催化活性和結(jié)合（見(jiàn)圖1）。這和前期關(guān)于野百合的基因的GO 注釋結(jié)果相似。

將本實(shí)驗(yàn)4種百合屬物種得到的unigene 序列分別與KOG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而預(yù)測(cè)其功能，并和野百合的KOG 注釋比較分析。結(jié)果顯示，在25個(gè)功能類別中，“一般功能預(yù)測(cè)”類別中的unigene在5種百合屬植物都是最多，其次是“翻譯后修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和分子伴侶”“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和機(jī)制”以及“RNA的處理和修飾”。在5個(gè)物種均是只有少數(shù)unigene序列注釋到“細(xì)胞運(yùn)動(dòng)”這一類別中（見(jiàn)圖2）。

2.3 花發(fā)育相關(guān)基因

百合屬植物是重要的觀花植物，花是百合重要的經(jīng)濟(jì)性狀。通過(guò)對(duì)百合屬植物花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的注釋和分析，共鑒別到13個(gè)花發(fā)育相關(guān)基因，包括MADS-box 基因、AGL 類基因和LIM 類基因等（見(jiàn)表3）。

2.4 百合屬5種植物的進(jìn)化分析以及直系同源基因的篩選

利用保守的單拷貝同源基因序列比對(duì)后，采用MEGA 構(gòu)建NJ 樹(shù)，其中野百合和細(xì)葉百合聚為一類，卷丹和百合聚為一類，而川百合單獨(dú)為一類（見(jiàn)圖3）。本研究中得到的直系同源基因序列可以用于開(kāi)發(fā)SSR 位點(diǎn)，為百合屬的遺傳標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供資源。

表3 鑒別的花發(fā)育相關(guān)的基因Table 3 Identified genes involved in the development of flower

通過(guò)orthomcl analysis 分析，在5 種百合屬植物中共得到9440 對(duì)單拷貝直系同源基因，計(jì)算這些直系同源基因的非同義替換（Ka）、同義替換率（Ks）、Ka/Ks。且數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格過(guò)濾后，共有8 247對(duì)直系同源基因被確定，其中32 對(duì)直系同源基因的Ka/Ks>1，表明這些基因受到了強(qiáng)烈的正向選擇；355 對(duì)直系同源基因的0.5

2.5 正選擇基因的GO和KEGG富集分析

對(duì)5 種百合屬植物的正選擇基因進(jìn)行GO 基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)正向選擇的基因功能在生物過(guò)程（Biological process）分類中主要集中在代謝過(guò)程（Metabolic process）上，在細(xì)胞組分（Cellular component）分類中主要集中在細(xì)胞器（organelle）、細(xì)胞（Cell）、細(xì)胞部分（Cell part），而在分子功能（Molecular function）分類中則主要集中在結(jié)合活性（Binding）、催化活性（Catalytic activity）上。強(qiáng)烈正選擇基因的KEGG 富集的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5種百合屬植物中，代謝途徑、萜類骨架的生物合成、苯基丙酸類生物合成以及植物-病原體的相互作用等通路相關(guān)的基因受到了比較強(qiáng)的正選擇作用（見(jiàn)表4）。

3 討論

3.1 百合屬4種植物花的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和注釋

目前Illumina 二代測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為獲取無(wú)參考基因組的物種基因數(shù)據(jù)的一種有效方法，廣泛應(yīng)用于抗性和活性成分基因的挖掘以及分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)應(yīng)用［18］。不同近緣物種的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析可以預(yù)測(cè)物種的選擇作用以及適應(yīng)性進(jìn)化。本研究通過(guò)二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較分析百合屬4 種植物花的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。通過(guò)組裝分別在細(xì)葉百合、川百合、卷丹以及百合的花朵中獲得44 565、51 413、41 638 和44 716 個(gè)unigene 序列。本研究獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將為未來(lái)這4 種植物的研究提供有用的數(shù)據(jù)和資源。

表4 強(qiáng)烈正向選擇的基因的KEGG通路Table 4 The enriched KEGG pathways of strongly positive selection unigenes

將獲得的基因序列在Nr、Swiss-Prot、GO、KOG和KEGG 等公共數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋，4 個(gè)物種中一半左右的基因在五大數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋信息，但是幾乎一半的基因沒(méi)有注釋信息，這可能是由于4種植物目前都沒(méi)有參考基因組信息，這些基因可能是百合屬特有的一些基因，這和前期關(guān)于野百合的注釋信息類似，都是大約50%的基因能匹配到注釋信息。通過(guò)比較本實(shí)驗(yàn)的4 種百合屬植物以及野百合中基因的GO 和KOG 注釋結(jié)果，發(fā)現(xiàn)5種百合屬植物花的轉(zhuǎn)錄本歸屬的分類條目類似，說(shuō)明5種植物在百合屬內(nèi)親緣關(guān)系較近。

3.2 花發(fā)育相關(guān)基因的分析

百合是多年生的宿根花卉植物，有球根“花卉之王”的美譽(yù)，花的形成和花器官的發(fā)育研究極其重要。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共鑒別了13個(gè)花發(fā)育相關(guān)的基因，控制植物花器官發(fā)育的基因大多數(shù)含有一個(gè)保守的MADS 結(jié)構(gòu)域。其中，MADS2基因參與胚珠的發(fā)育［19］，并且Tzeng 等在麝香百合中克隆到了MADS2 基因，MADS2 基因僅在胚珠中表達(dá)，在花的其他部位中不表達(dá)［20］。除此之外，目前在麝香百合中還克隆出了MADS1、MADS3 和MADS4基因，它們分別參與雄蕊和花瓣的發(fā)育［21］。在本研究中鑒別到的MADS6基因參與調(diào)控花分生組織的分化和開(kāi)花時(shí)間［22～23］，MADS14 基因調(diào)控開(kāi)花時(shí)間［22］。Wang 等研究表明過(guò)表達(dá)MADS-box 轉(zhuǎn)錄因子BpPI 可以延遲開(kāi)花［24］。MADS16 基因參與花被和雄蕊的發(fā)育［25～26］。在樺樹(shù)中，研究發(fā)現(xiàn)BpAP1 可以促進(jìn)其雄花序的形成［27］。在AGL 基因家族中，AGL104 基因和AGL3 基因參與花粉的成熟與花粉管的生長(zhǎng)［28］，AGL8 基因參與花分生組織的分化［29］。AGL19 基因可以響應(yīng)春化作用，促進(jìn)開(kāi)花，而AGL15 基因參與開(kāi)花的負(fù)調(diào)控［30］。另外，本研究中鑒別到的SOC1 基因和EJ2 基因分別調(diào)控開(kāi)花時(shí)間以及花的發(fā)育和形成［31］。LIM 類基因LIM15 是與減數(shù)分裂相關(guān)基因，在染色體的配對(duì)和重組起重要作用［32］。Mori等在百合中克隆到了與花粉發(fā)育相關(guān)的GlsA基因，其僅僅在花粉的發(fā)育過(guò)程中表達(dá)［33］。本研究中鑒別的花發(fā)育相關(guān)基因可以為進(jìn)一步研究百合花器官發(fā)育和調(diào)控提供基礎(chǔ)。

3.3 百合屬5種植物的直系同源基因以及正選擇基因

Ka/Ks 值常用來(lái)驗(yàn)證蛋白質(zhì)編碼基因是否經(jīng)歷選擇作用。正選擇作用是物種對(duì)環(huán)境因素的適應(yīng)手段之一。本研究共檢測(cè)到32對(duì)強(qiáng)烈的正向選擇基因（Ka/Ks>1）以及355 對(duì)弱的正向選擇基因（0.5

在植物病原體的相互作用途徑中，發(fā)現(xiàn)了正選擇基因疾病抗性蛋白R(shí)PM1 基因，RPM1 基因是NBS-LRR 基因中的一員，RPM1 基因通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)使植物體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)，加強(qiáng)植株的抗病性，造成病原菌感染區(qū)域及周圍組織細(xì)胞程序性凋亡，使病原菌不會(huì)擴(kuò)散到健康的組織器官中，從而達(dá)到抗病目的。對(duì)大豆灰斑病表現(xiàn)出正向調(diào)控的抗性［34］。過(guò)氧化物酶57基因參與苯丙烷類化合物木質(zhì)素的生物合成。苯丙烷類化合物作為植物抗逆保護(hù)因子及特定環(huán)境下的次生代謝產(chǎn)物對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及應(yīng)答逆境脅迫具有重要作用，特異性調(diào)控苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因的表達(dá)可以增強(qiáng)植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性［35］。一些研究表明正選擇直系同源基因常常與生物和非生物脅迫、生物合成、代謝過(guò)程和酶相關(guān)［9，35～37］。本研究也發(fā)現(xiàn)了抗性以及參與代謝相關(guān)的正向選擇基因。