陳 芳 佘婷婷 張 琳 高浩天 李國(guó)梁 王 健，*

（1. 安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，安康 725000；2. 陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021；3. 教育部藥用植物資源與天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和西北瀕危藥材資源開(kāi)發(fā)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西安 710062）

MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的內(nèi)源單鏈非編碼RNA，主要通過(guò)切割靶基因mRNA 或抑制靶mRNA 翻譯來(lái)調(diào)控植物個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和環(huán)境脅迫應(yīng)答等生理過(guò)程［1］。隨著在模式植物中對(duì)miRNA調(diào)控次生代謝途徑的研究逐漸深入，越來(lái)越多的證據(jù)顯示miRNAs 在植物，尤其是某些經(jīng)濟(jì)類(lèi)作物以及藥用植物次生代謝途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。例如，在擬南芥體內(nèi)，miR156通過(guò)對(duì)其靶標(biāo)基因SPL9的下調(diào)進(jìn)而調(diào)控花青素、黃酮醇以及倍半萜等活性成分的含量［2～3］；miR159a 通過(guò)下調(diào)黃酮醇合酶（Flavonol synthase）基 因 調(diào) 控 花 青 素、黃 酮 醇 的 合 成［4］；miR828 通過(guò)觸發(fā)ta-siRNAs 的形成下調(diào)R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因PAP1、PAP2 以及MYB113 的表達(dá)進(jìn)而廣泛調(diào)控花青素的合成［5］。在其他植物中，如蘋(píng)果中miR858通過(guò)對(duì)其靶標(biāo)MYB基因家族的下調(diào)調(diào)控花青素以及原花青素的代謝；紅豆杉中miR164 和miR171 對(duì)其體內(nèi)紫杉烷二萜生物合成的調(diào)控［6］；長(zhǎng)春花中miR5021 以及棉花中miR8156和miR8170對(duì)萜類(lèi)吲哚生物堿合成的調(diào)控［7～8］。

丹參是我國(guó)傳統(tǒng)大宗道地藥材，為唇形科鼠尾草屬植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根莖。近年來(lái)，隨著對(duì)丹參體內(nèi)次生代謝合成調(diào)控研究的逐漸深入，丹參被視為研究藥用植物次生代謝途徑的理想材料。丹參體內(nèi)活性成分酚酸類(lèi)化合物由酪氨酸代謝途徑和苯丙烷類(lèi)代謝途徑兩條支路共同參與而成［9］。在植物次生代謝途徑中，MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子已被證實(shí)廣泛參與苯丙烷類(lèi)代謝途徑的調(diào)控［10］。目前對(duì)丹參酚酸類(lèi)化合物生物合成途徑調(diào)控機(jī)制的研究主要側(cè)重于探討相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與關(guān)鍵酶基因表達(dá)的調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄因子自身表達(dá)調(diào)控的研究報(bào)道較為少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照株系相比，丹參SmPAP1特異性基因沉默轉(zhuǎn)化株系中酚酸類(lèi)化合物合成途徑中酶基因以及丹酚酸B 等酚酸類(lèi)活性含量均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)［11］。由此推測(cè)SmPAP1 作為一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與丹參酚酸類(lèi)活性物質(zhì)的代謝調(diào)控，但目前關(guān)于丹參體內(nèi)SmPAP1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

鑒于此，研究選取實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)對(duì)丹參Small RNA 高通量測(cè)序獲得的一條成熟miR858（命名為Sm-miR858）為對(duì)象，首先通過(guò)Small RNA Northern blotting 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該Sm-miR858 序列的真實(shí)性，然后基于在線軟件預(yù)測(cè)Sm-miR858 的靶標(biāo)基因，并通過(guò)Real-time PCR 分析Sm-miR858 和潛在靶標(biāo)SmPAP1之間表達(dá)水平的負(fù)相關(guān)性，再通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)體系驗(yàn)證Sm-miR858 的表達(dá)量對(duì)SmPAP1 表達(dá)水平的影響，明確丹參體內(nèi)存在的Sm-miR858對(duì)SmPAP1的靶向負(fù)調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

研究所用的植物丹參和煙草幼苗均來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)。用于構(gòu)建Sm-miR858 和Sm-PAP1植物表達(dá)載體的pCambia1302，大腸桿菌DH5α 和根癌農(nóng)桿菌EHA105 均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室。用于overlapping PCR 模板的質(zhì)粒pRSC300（weigel@weigel?world.org.）由中科院遺傳所友情贈(zèng)送提供。cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒Primer ScriptTMRT Reagent Kit、One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 購(gòu)自中國(guó)大連TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其在煙草葉片中的瞬時(shí)表達(dá)

對(duì)于Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，首先利用在線軟件WMD（http：//wmd3.weigelworld.org/）設(shè)計(jì)用于over-Lapping PCR 的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ引物（見(jiàn)表1），然后以質(zhì)粒pRSC300為模板進(jìn)行擴(kuò)增，使其形成合適、對(duì)應(yīng)于載體中擬南芥miR319a與miR319a*之間的“莖環(huán)”狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，over-Lap?ping PCR 所采用的方法和步驟均嚴(yán)格按照“Clon?ing of artificial microRNAs”P(pán)rotocol by Rebecca Schwab操作方法進(jìn)行［12］。隨后以測(cè)序正確的over-Lapping PCR 產(chǎn)物為模板，在引物Ⅰ和Ⅲ兩端分別加上BglⅡ和BstEⅡ酶切位點(diǎn)以形成用于PCR 的上游引物（5′CATGGTNACCgaTTCATTGTCTGTTC?GACCTTA3′）和上游引物（5′CATAGATCTgaTAC?GGTCGAACAGTCAATGAT3′）對(duì)Sm-miR858 與Sm-miR858*之間的前體“莖環(huán)”狀二級(jí)結(jié)構(gòu)序列進(jìn)行再次擴(kuò)增。其后PCR 產(chǎn)物的酶切及其與pCam?bia1302 的連接、重組載體對(duì)農(nóng)桿菌EHA105 的轉(zhuǎn)化均參照文獻(xiàn)［13］所描述的方法進(jìn)行，構(gòu)建的SmmiR858植物過(guò)表達(dá)載體命名為35S：Sm-miR858。

對(duì)于Sm-PAP1 植物過(guò)表達(dá)載體（35S：Sm-PAP1）的構(gòu)建以及包含有重組目的載體農(nóng)桿菌的活化、搖菌、菌液濃度值的測(cè)定、乙酰丁香酮的添加、農(nóng)桿菌液對(duì)煙草葉片的注射等詳細(xì)操作步驟以及注射后煙草植物的培養(yǎng)條件和時(shí)間完全按照文獻(xiàn)［14］里面的操作方法進(jìn)行。

1.2.2 植物RNA 的提取以及Sm-miR858 和Sm-PAP1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中植物的總RNA 提取采用鹽酸胍法，試劑配制及具體操作程序均參照Bubier 和Schlappi所述方法進(jìn)行［15］。采用甲醛變性膠進(jìn)行總RNA提取完整度的檢測(cè)。對(duì)于miRNA 表達(dá)豐富的檢測(cè)，為了減少DNA 的干擾，在反轉(zhuǎn)錄之前利用DNaseⅠ對(duì)所提取的總RNA 里面殘存的痕量DNA 進(jìn)行去除，然后使用miRNA 加尾及反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)經(jīng)過(guò)純化的總RNA 里面的miRNAs 進(jìn)行polyA 加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄，詳細(xì)操作步驟均按照One step Primer miRNA cDNA Synthesis Kit 進(jìn)行。利用（5′TTCATTGTCTGTTCGACCTT3′）和 通 用 引 物Uni-miR qPCR primer （5′GACTGCGATCTCT CTTTTGTATTCC3′）作為Real-Time qPCR（RT-qP?CR）的上、下游引物，丹參及煙草的Ubiquitin 基因作為各自RT-qPCR 的內(nèi)參照基因；對(duì)于Sm-PAP1表達(dá)水平的檢測(cè)，使用常規(guī)cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)經(jīng)純化的總RNA 里面的mRNAs 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以生成cDNAs 鏈。RT-qPCR 反應(yīng)程序及溫度設(shè)定參照“IQTM5 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 說(shuō)明”進(jìn)行操作，具體引物序列見(jiàn)表1。

表1 Over-lapping PCR和RT-qPCR所用引物序列信息Table 1 List of primers used for Over-lapping PCR and RT-qPCR

1.2.3 Small RNA Northern blotting雜交檢測(cè)

在電泳上樣之前，首先使用50%的PEG 8000以及3.0M 的NaAc 對(duì)提取且經(jīng)過(guò)完整度檢測(cè)的總RNA 進(jìn)行重新沉淀、富集，以增加樣品中miRNAs的濃度。然后配制含有15%尿素的聚丙烯酰胺（PAGE）膠，灌制膠于玻璃槽上，靜置1 h 左右。將RNA 樣品用2×Small RNA 上樣緩沖液稀釋?zhuān)来螌NA 樣品加入到上樣孔中，靜置5 min。然后用150 V 的電壓跑膠1.5 h 左右直至樣品到達(dá)膠底部，再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、交聯(lián)、預(yù)雜交、探針的標(biāo)記、雜交、壓片及曝光等操作，具體操作參照Li 等操作方法［16］。實(shí)驗(yàn)使用T4PNK 對(duì)探針進(jìn)行P32的同位素標(biāo)記以增加雜交檢測(cè)的靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sm-miR858 序列的保守性分析及其真實(shí)性驗(yàn)證

miR858 在相關(guān)植物體內(nèi)的報(bào)道并不多見(jiàn)，截止目前，僅陸續(xù)在擬南芥、番茄、蘋(píng)果等植物中被鑒定［6，17～18］，因此，為了研究miR858的序列保守性，本實(shí)驗(yàn)將Sm-miR858 和上述物種中的miR858 序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1a），7種植物中都具有“UUGUCUGUUCGACCU”這一高度保守的核心序列，但Sm-miR858 的序列長(zhǎng)度只有20nt，其它6 種植物miR858 的序列長(zhǎng)度均為21nt；與擬南芥miR858 相比，Sm-miR858 除了第4 個(gè)核苷酸為A 外，其它位置的核苷酸種類(lèi)完全一樣；與棉花miR858 相比，Sm-miR858 從第1 個(gè)到第19 個(gè)核苷酸種類(lèi)完全一樣；與其它3 個(gè)物種的miR858 序列分別存在2～3 個(gè)核苷酸的差異。序列比對(duì)結(jié)果說(shuō)明，與其它已經(jīng)鑒定的miR858相比，Sm-miR858具有高度的序列保守性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SmmiR858 序列在丹參體內(nèi)的真實(shí)存在，本實(shí)驗(yàn)以Sm-miR858 的反向互補(bǔ)序列為探針?lè)謩e對(duì)丹參的根、莖和葉組織進(jìn)行Small RNA Northern blotting 雜交驗(yàn)證，同時(shí)以Sm-miR156 的Small RNA blotting雜交作為陽(yáng)性對(duì)照。雜交信號(hào)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1b），Sm-miR858 在丹參的根、莖和葉組織中均有表達(dá)，葉中表達(dá)水平最高，根中次之，莖中最低，但表達(dá)水平均不高，明顯低于Sm-miR156 在上述組織中的表達(dá)水平，這與研究團(tuán)隊(duì)前期丹參Small RNA 高通量測(cè)序中顯示的不同miRNAs 的Reads是高度一致的，在丹參Small RNA高通量測(cè)序結(jié)果中，Sm-miR156 有33949 個(gè)Reads，而Sm-miR858 僅僅有904 個(gè)Reads。基于Small RNA blotting 雜交結(jié)果，我們可以確認(rèn)在丹參體內(nèi)該Sm-miR858 序列的真實(shí)性。

2.2 丹參體內(nèi)Sm-miR858靶標(biāo)基因的預(yù)測(cè)

植物miRNA是通過(guò)促進(jìn)靶標(biāo)基因mRNA的降解或翻譯抑制來(lái)負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育等功能作用，因此，為了研究Sm-miR858 的功能，我們首先利用psRNATarget（http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/home）（一款專(zhuān)門(mén)對(duì)植物miRNA靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測(cè)的在線分析服務(wù)器），以最新的丹參基因組編碼基因CDS 文庫(kù)為對(duì)象對(duì)Sm-miR858 的靶標(biāo)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)［19］。在線分析結(jié)果顯示，Expect 值小于2.5 的靶標(biāo)基因共有13 個(gè)，其中MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因10 個(gè)，超大鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白基因1個(gè)，另外兩個(gè)靶基因功能不詳。在這些潛在的靶標(biāo)基因中，有一個(gè)R2R3-MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因Sm-PAP1（見(jiàn)圖2a）。該基因是一個(gè)重要的參與丹參酚酸類(lèi)活性物質(zhì)代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子基因，與其他物種中已鑒定的miR858靶標(biāo)基因具有高度的相似性。為了進(jìn)一步分析Sm-miR858 對(duì)靶標(biāo)基因Sm-PAP1 的準(zhǔn)確性，我們挑選了已經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的擬南芥和葡萄中miR858靶標(biāo)基因的作用位點(diǎn)并與Sm-miR858的靶向作用位點(diǎn)進(jìn)行比較分析。位點(diǎn)分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖2b），Sm-miR858 的靶向作用位點(diǎn)位于Sm-PAP1cDNA 的 第290～309 的 核 苷 酸 序 列，AtmiR858 和Vv-miR858 的靶向作用位點(diǎn)分別位于AtMYB104 和VvMYB114 cDNA 序列的第365～385以及第551～571 的片段，這些不同植物中miR858的靶向作用位點(diǎn)在核苷酸序列上具有高度的特異性（見(jiàn)圖2c），都編碼PGRTDNE這樣一段特異的氨基酸多肽序列（見(jiàn)圖2d），該多肽序列呈現(xiàn)高度的保守型，均位于R2R3-MYB 基因家族的R3 結(jié)構(gòu)域內(nèi)。因此，基于上述這些分析結(jié)果，我們認(rèn)為在丹參體內(nèi)Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶標(biāo)基因在理論上是可行的。

2.3 丹參體內(nèi)Sm-miR858 和潛在靶標(biāo)基因Sm-PAP1之間的表達(dá)相關(guān)性分析

運(yùn)用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)的靶基因僅是理論分析得出的結(jié)果，存在一定的假陽(yáng)性。鑒于在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中miRNA的表達(dá)具有高度的組織及時(shí)空特異性，不同組織中miRNA 及其靶基因共表達(dá)水平相關(guān)性分析的檢測(cè)便成為miRNA生物學(xué)功能研究的重要信息和依據(jù)?；诖?，為了進(jìn)一步分析丹參體內(nèi)Sm-miR858 是否作用于靶標(biāo)基因Sm-PAP1，利用Real-time qPCR 分別對(duì)丹參根、莖、葉及花不同組織中Sm-miR858 和SmPAP1 的組織特異性表達(dá)水平進(jìn)行分子檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3a），與Small RNA Northern blotting 高度一致，Sm-miR858 在葉中表達(dá)水平最高，然后是花及根中，在莖中的表達(dá)水平最低，葉中的表達(dá)水平幾乎是莖中的5 倍；反觀SmPAP1 的組織表達(dá)水平（見(jiàn)圖3b），在莖中最高，隨后是根中，葉及花中表達(dá)水平均較低，在莖中的表達(dá)水平幾乎是葉中的4倍。二者在丹參相關(guān)各組織中的表達(dá)水平之間存在著明顯的負(fù)相關(guān)性。這種表達(dá)水平之間的負(fù)相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步暗示，在丹參體內(nèi)Sm-PAP1的表達(dá)可能被Sm-miR858靶向負(fù)調(diào)控。

2.4 Sm-miR858 靶向負(fù)調(diào)控Sm-PAP1 表達(dá)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

盡管通過(guò)靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果和Sm-miR858、Sm-PAP1 二者之間存在的明顯表達(dá)負(fù)相關(guān)性均表明Sm-miR858 的靶標(biāo)基因是Sm-PAP1，但仍缺少直接的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了進(jìn)一步確認(rèn)在丹參體內(nèi)存在著Sm-miR858 對(duì)Sm-PAP1 基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控關(guān)系，研究分別構(gòu)建Sm-miR858 和Sm-PAP1 的植物過(guò)表達(dá)載體，利用煙草瞬時(shí)表達(dá)體系將Sm-PAP1植物過(guò)表達(dá)載體和Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體在煙草葉片細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)共表達(dá)，以檢測(cè)是否存在Sm-miR858 的過(guò)表達(dá)對(duì)Sm-PAP1 的mRNA 水平進(jìn)行顯著的下調(diào)。為了減少實(shí)驗(yàn)的誤差，隨機(jī)選取被農(nóng)桿菌菌液浸潤(rùn)的3 株煙草植株相近部位的多個(gè)不同葉片進(jìn)行總RNA 的提取以進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析在不同的葉片中不同的SmmiR858 表達(dá)水平對(duì)Sm-PAP1 表達(dá)的影響。首先利用Small RNA Northern blotting 檢測(cè)了在不同煙草葉片細(xì)胞中Sm-miR858 的瞬時(shí)表達(dá)情況，以U6作為總RNA 上樣量?jī)?nèi)參，以檢驗(yàn)Sm-miR858 是否能夠在煙草細(xì)胞中表達(dá)以及表達(dá)序列的真實(shí)性。雜交結(jié)果如圖4a 所示，在3 泳道中都檢測(cè)到了雜交信號(hào)，表明3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Sm-miR858 都有表達(dá)，證明構(gòu)建的Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體中的人工莖環(huán)結(jié)構(gòu)在煙草細(xì)胞中能夠被正確加工、剪切并表達(dá)；同時(shí)在陰性對(duì)照組（僅含pCambia1302 空載體）中無(wú)任何雜交信號(hào)出現(xiàn)，說(shuō)明在煙草細(xì)胞中不存在與Sm-miR858 一樣的內(nèi)源miRNA 序列存在。但不同實(shí)驗(yàn)組中Sm-miR858 的瞬時(shí)表達(dá)水呈現(xiàn)出一定的差異，2#實(shí)驗(yàn)組煙草葉片中Sm-miR858 的表達(dá)水平最高，1#組中略微降低，3#組中表達(dá)水平最低，推測(cè)造成Sm-miR858 植物過(guò)表達(dá)載體在不同實(shí)驗(yàn)組煙草葉片中的表達(dá)水平不一致的原因可能跟菌液的浸潤(rùn)程度不一致有關(guān)。接下來(lái)對(duì)3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組煙草組織中Sm-PAP1 及Sm-miR858 的瞬時(shí)共表達(dá)水平進(jìn)行了Real-time qPCR 檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示（見(jiàn)圖4b），與陰性對(duì)照組（僅含35S：Sm-PAP1 表達(dá)載體）相比，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組中Sm-PAP1 的mRNA 水平在Sm-miR858 過(guò)表達(dá)情況下均出現(xiàn)下降，且Sm-PAP1 mRNA 水平下降的程度與SmmiR858 的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)性，即在2#實(shí)驗(yàn)組中Sm-miR858 的表達(dá)水平最高，Sm-PAP1 的mRNA 表達(dá)水平最低；而在3#實(shí)驗(yàn)組中SmmiR858 的表達(dá)水平最低，Sm-PAP1 的mRNA 表達(dá)水平相對(duì)較高，呈現(xiàn)出顯著的“劑量效應(yīng)”。由于在上述煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中Sm-PAP1 的mRNA 表達(dá)水平直接受Sm-miR858 表達(dá)水平的調(diào)控，因此，可以證明Sm-PAP1 在mRNA 表達(dá)水平上確受Sm-miR858的靶向負(fù)調(diào)控。

3 討論

近年來(lái)，通過(guò)構(gòu)建小RNA 文庫(kù)進(jìn)行直接測(cè)序和利用生物學(xué)信息法（in silico）已經(jīng)獲得了許多植物物種的不同miRNA 序列，如miR858在擬南芥和其它一些植物物種中已陸續(xù)被鑒定。然而大部分miR858 在植物體內(nèi)的生物學(xué)功能仍未知，特別是在一些重要的藥用植物如丹參中的生物學(xué)功能急需研究清楚。目前對(duì)丹參酚酸類(lèi)活性成分合成途徑調(diào)控機(jī)制的研究主要側(cè)重于探討相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子參與關(guān)鍵酶基因表達(dá)調(diào)控上，而對(duì)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子自身表達(dá)調(diào)控尤其是如何被體內(nèi)相關(guān)miRNA調(diào)控的研究報(bào)道較少。研究團(tuán)隊(duì)前期通過(guò)對(duì)丹參Small RNA 高通量測(cè)序獲得了一條在其他植物中已經(jīng)鑒定出來(lái)的miR858高度相似的miRNA 序列，命名為Sm-miR858。丹參是傳統(tǒng)大宗道地藥材，隨著對(duì)丹參體內(nèi)次生代謝合成調(diào)控研究的逐漸深入，丹參已被視為研究藥用植物次生代謝途徑的理想研究材料。但截至目前Sm-miR858 在丹參體內(nèi)的生理功能尚不清楚，本研究圍繞Sm-miR858在丹參體內(nèi)的生理功能展開(kāi)研究，為深入研究丹參體內(nèi)次生代謝合成調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)miR858 的靶標(biāo)基因絕大多數(shù)都屬于MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，尤其是R2R3-MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，比如在擬南芥中4個(gè)與黃酮類(lèi)合成密切相關(guān)的R2R3-MYB 被miR858 靶向調(diào)控，棉花中多達(dá)20 個(gè)R2R3-MYBs，蘋(píng)果中66 個(gè)MYBs，其中絕大多數(shù)都與苯丙烷類(lèi)代謝途徑相關(guān)［6，17，20］。除了miR858 對(duì)MYB 類(lèi)基因進(jìn)行靶向調(diào)控外，miR828 也對(duì)一些MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控，并且作用位點(diǎn)均位于MYB 基因的高度保守的R3 結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的核苷酸序列區(qū)。MiR858 的作用位點(diǎn)在miR828 作用位點(diǎn)的上游區(qū)，并且作用位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的核苷酸序列更為保守［6］。在研究miRNA 作用靶標(biāo)基因預(yù)測(cè)結(jié)果中，顯示Sm-PAP1 是Sm-miR858 潛在的靶標(biāo)基因。有研究表明，Sm-PAP1 是一個(gè)重要的參與丹參體內(nèi)酚酸類(lèi)代謝途徑調(diào)控的R2R3-MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子［11］。從不同植物miR858 核心種子區(qū)序列比對(duì)來(lái)看，丹參Sm-miR858和其他已經(jīng)鑒定的miR858s完全一致。因?yàn)閙iRNA核心種子區(qū)與靶標(biāo)基因作用位點(diǎn)核苷酸序列之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)狀況對(duì)miRNA 的剪切或翻譯抑制作用是至關(guān)重要的，在這個(gè)區(qū)域序列的差異將直接影響miRNA的剪切或翻譯抑制效率。從Sm-miR858 對(duì)Sm-PAP1 作用位點(diǎn)來(lái)看，其核苷酸序列及其對(duì)應(yīng)的氨基酸保守序列PGRTDNE 也是高度一致的，顯示出了不同植物中miR858 功能的高度保守性。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Sm-miR858 的潛在靶標(biāo)基因僅有Sm-PAP1，并且在我們的丹參Small RNA 高通量測(cè)序結(jié)果中也沒(méi)有相關(guān)的miR828 序列出現(xiàn)，這似乎與其他雙子葉植物中MYB 類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子被miR858和miR828 雙重調(diào)控現(xiàn)象不一致。我們分析出現(xiàn)這種結(jié)果的可能原因有兩方面，一方面是研究所提供的丹參cDNA 文庫(kù)的基因表達(dá)信息量不夠?qū)е耂m-miR858 的預(yù)測(cè)靶標(biāo)沒(méi)有出現(xiàn)；另一方面可能是丹參Small RNA 高通量測(cè)序深度不夠沒(méi)有檢測(cè)到丹參體內(nèi)MiR828的序列信息。

總之，論文依次對(duì)從丹參Small RNA高通量測(cè)序獲得的Sm-miR858 進(jìn)行序列真實(shí)性驗(yàn)證、靶標(biāo)預(yù)測(cè)以及Sm-miR858 與Sm-PAP1 之間表達(dá)相關(guān)性等進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。研究結(jié)果證實(shí)在丹參體內(nèi)Sm-PAP1 是Sm-miR858 的靶標(biāo)基因。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果為在miRNA水平通過(guò)基因工程提高丹參體內(nèi)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)奠定了理論基礎(chǔ)。

致謝 感謝陜西師范大學(xué)王喆之教授在實(shí)驗(yàn)構(gòu)思上所給予的指導(dǎo)和幫助。