范永慧，張永紅，王永生，吳銀吉

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，蒙自市 661101）

祥云縣是云南蠶桑產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點縣之一，現(xiàn)有桑園面積6 866.7 hm2，2019 年全縣年發(fā)種量約15萬張，鮮繭產(chǎn)量約0.6萬t，蠶桑綜合產(chǎn)值達(dá)34億元［1］?，F(xiàn)已建成青坡、松梅、新澤等30多個蠶桑重點村和科技示范村。2018—2019 年，各蠶區(qū)已零星出現(xiàn)排連珠狀蠶糞的病蠶，當(dāng)?shù)匦Q農(nóng)根據(jù)經(jīng)驗初步診斷為細(xì)菌性腸道病，但沒有引起足夠重視。2019 年8 月初開始飼養(yǎng)的正秋蠶普遍發(fā)生該病，尤其是最大的養(yǎng)蠶村——松梅村受影響最嚴(yán)重，具體情況為飼養(yǎng)量約4 500張，受此病害損失近1 000張，造成蠶農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失慘重。

通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，這種蠶病在3齡蠶中發(fā)生較少，5齡起蠶后病勢嚴(yán)重，隨即迅速擴(kuò)散，至第3～4 d 暴發(fā)，肉眼觀察病征表現(xiàn)為群體發(fā)育不齊，食桑量少且不活潑，繼而蠶體變小，最后停止食桑死亡，蠶體腐爛；撕開病蠶體壁觀察中腸，腸內(nèi)桑葉很少，充滿黃綠色液體。病蠶最顯著特征就是排連珠狀蠶糞，具體表現(xiàn)為幾顆蠶糞之間有絲相連，像一串念珠，也可表述為念珠狀蠶糞。查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料可知，排連珠狀蠶糞或念珠狀蠶糞的蠶病分別有細(xì)菌性腸道?。?-3］、濃核?。?-6］、黑尾病［7］、壁虱病［8］，另外，氯蟲苯甲酰胺導(dǎo)致蠶中毒［9］也會出現(xiàn)排連珠狀蠶糞。

家蠶濃核病毒（Bombyx mori Densovirus，BmDNV），又稱家蠶二分濃核病毒（Bombyx mori bidensovirus，BmBDV），BmDNV 存在不同的株系和基因組類型（BmDNV 1～6 型、BmDNV-Z 型），中國流行的病毒以BmDNV-1（伊那株）和BmDNV-3（桐鄉(xiāng)株）的分離株為主。筆者對病蠶的中腸進(jìn)行鏡檢，未發(fā)現(xiàn)球形細(xì)菌，結(jié)合上述幾種蠶病的主要病征和蠶戶養(yǎng)蠶各環(huán)節(jié)技術(shù)操作情況及低溫多濕的飼養(yǎng)環(huán)境，初步推測為家蠶濃核病，但需通過PCR 分子檢測方法和感染試驗近一步來確認(rèn)是否為BmDNV。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 家蠶品種 菁松×皓月，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所家蠶研究室提供。

1.1.2 病毒取樣 家蠶濃核病毒BmDNV的病蠶樣品采集于云南省祥云縣正秋蠶期的排連珠狀蠶糞蠶病最嚴(yán)重，發(fā)病量高達(dá)20%以上的松梅村的4家農(nóng)戶。

1.1.3 引物和主要試劑 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫上已登陸的BmDNV-3 株基因組片段VD1 ORF2 序列設(shè)計特異性引物（表1），由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系（10×PCR buffer、dNTPs和Ex-Taq聚合酶）、50×TAE電泳緩沖液、瓊脂糖購于上海生工生物工程公司。

1.2 病毒生物學(xué)鑒定方法

1.2.1 檢測依據(jù) 根據(jù)NCBI 已報道BmDNV-3（DQ017268）基因組VD1 ORF2序列（大小為975 bp）設(shè)計特異性引物，通過PCR 產(chǎn)物大小來判斷采集的病蠶樣品是否感染BmDNV。

1.2.2 病毒粒子收集與基因組提取 取病蠶中腸組織用滅菌水研磨，紗布過濾勻漿液，4 000 rpm離心20 min，過濾數(shù)次，收集病毒混合液加到含1 mL基因組抽提液（10 mmol/L Tris-Cl，pH 8.0；0.1 mol/L EDTA，pH 8.0；0.5%SDS）的離心管中同時加入蛋白酶K 在55 ℃下水浴消化2 h；用Tris平衡酚、酚∶氯仿（1∶1）、酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶l）、氯仿各抽提1次；用無水乙醇沉淀基因組，70%乙醇洗滌DNA，最后用適量TE溶液溶解沉淀，溶液用于PCR檢測［10］。

1.2.3 病毒基因組PCR擴(kuò)增檢測 參照張永紅等［10］方法以抽提的病毒基因組作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（Mg2+）5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，cDNA 模板1 μL，Ex-Taq DNA 聚合酶0.25 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O至50 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，在72 ℃下終止延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測。

1.3 病原感染力、感染癥狀試驗方法

將病毒混合液涂抹于桑葉背面，稍晾干后分別添食于4 齡起蠶和5 齡起蠶，各齡添毒分A、B、C 和CK 4 組。A 組直接添食病毒混合液，B 組添食稀釋10倍的病毒混合液，C組添食病毒混合液，每天添食1 次鹽酸環(huán)丙沙星（人用），1 粒兌500 mL 水。CK 組飼喂正常葉，4 齡添食每組50 頭蠶，5 齡添食每組30頭蠶，3個重復(fù)，餉食添毒1次后開始飼喂正常桑葉，家蠶飼養(yǎng)置于同一溫濕度環(huán)境下，操作方法一致，每天給桑3次，觀察記錄家蠶的生長狀況、病情及病程，并解剖癥狀明顯、尤其是排連珠狀糞便的蠶兒，觀察中腸病變。最后，分別收集添食4齡起蠶和5齡起蠶發(fā)病后的病蠶，提取病毒粒子及病毒基因組再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒生物學(xué)鑒定的PCR檢測結(jié)果

祥云縣4 戶蠶農(nóng)病蠶樣品抽提基因組后，VD1 ORF2上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠檢測發(fā)現(xiàn)與目的片段大小基本一致的條帶（圖1），初步確定該地區(qū)2組（第3和第4）樣品家蠶感染BmDNV。

圖1 祥云縣4個樣品的病蠶基因組BmDNV3--F/R PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果

2.2 病原感染力、感染癥狀試驗

2.2.1 4齡添食感染試驗結(jié)果 96 h后CK組全眠，B、C 組眠1/2，A 組大多數(shù)不眠（圖2），B 組未眠蠶排連珠狀糞便。120 h后，A、B、C組未眠蠶出現(xiàn)排連珠狀糞便，A組蠶整體比其他組瘦小，且只有1/3蠶眠，未眠蠶爬于飼養(yǎng)盒壁，食桑量很少，蠶體瘦小，尾角后方粘有一粒不成形蠶糞，B、C 組個別未眠。156 h后，5 齡餉食，A 組未眠蠶排褐色液體，逐漸停止食桑，蠶體縮短，體色為米黃色，和5 齡起蠶顏色很相似。5齡第1 d到第6 d，A、B、C每組每天均出現(xiàn)排連珠狀蠶糞蠶兒（圖3、圖4），對照CK組，蠶體開差程度表現(xiàn)為：A 組＞B 組＞C 組（圖5、圖6），食桑量表現(xiàn)為：A組＜B組＜C組。5齡第3 d，A組和B組體色不轉(zhuǎn)青，排稀糞，蠶體縮小，現(xiàn)死蠶，C組與CK組對照，除個別體色不轉(zhuǎn)青，其余并無差別。5 齡第6 d，C 組蠶兒開始爬邊，體軀比CK組小，體色較CK組體色偏黃。A 組和B 組出現(xiàn)的死蠶，皮干皺縮呈米黃色，不易腐爛（圖7），解剖可見中腸腸腔前端沒有桑葉，中部充滿淡黃色腸液，腸液中有較少綠色桑葉（圖8）。

圖2 不眠蠶

圖3 排連珠狀蠶糞

圖4 排連珠狀蠶糞

圖6 4齡添食群體發(fā)育狀況

圖7 病死蠶

圖8 排連珠狀蠶糞蠶體解剖

2.2.2 5齡添食感染試驗結(jié)果 前3 d和CK組無明顯變化，第4 d的A、B組現(xiàn)排連珠狀蠶糞個體，第5 d的A 組食桑量減少，蠶體瘦小，體色偏黃，第8 d 的CK 組正常上蔟，A 組蠶體開差大于B 組，C 組和CK組無差別，只是個別不結(jié)繭，第9 d上午的結(jié)繭數(shù)為C組＞B組＞A組。

家蠶添食帶毒桑葉試驗中，4 齡起蠶添毒后第3～4 d出現(xiàn)明顯癥狀，5齡起蠶添毒后第5～7 d出現(xiàn)癥狀。主要癥狀表現(xiàn)為：初始階段群體中出現(xiàn)食桑逐漸減少、行動遲緩、爬于蠶座邊緣、排連珠狀蠶糞，眠期表現(xiàn)為遲眠或不眠，不蛻皮或半蛻皮，中期體色由青白轉(zhuǎn)成米黃色，體軀瘦小，體長縮短，排稀糞，末期停止食桑，平伏于蠶座至死亡的個體。

通過病蠶樣品PCR 檢測初步確診，再到添毒試驗發(fā)病病癥的相似，結(jié)合再次對添毒發(fā)病蠶進(jìn)行PCR檢測（圖9所示，第1～3頭為4齡添食發(fā)病蠶、第4～6 頭為5齡添食發(fā)病蠶），最后可以確診祥云蠶區(qū)排連珠狀蠶糞癥狀的蠶病為家蠶病毒病濃核病。

3 討論與建議

3.1 討論

由于排連珠狀蠶糞或念珠狀蠶糞的蠶病有多種，由此，在云南祥云縣發(fā)生的排連珠狀蠶糞癥狀的蠶病可能不是同一種病，但都具有很強(qiáng)的傳染能力，且造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。不同蠶病的發(fā)病機(jī)理、發(fā)病過程、飼育環(huán)境也不同，結(jié)合祥云縣蠶病病征、飼料質(zhì)量管理、蠶室內(nèi)外環(huán)境、養(yǎng)蠶人員的皮膚無紅疹狀和發(fā)癢、發(fā)病急緩等情況，可以排除是黑尾病、壁虱病、氯蟲苯甲酰胺導(dǎo)致的蠶中毒［7-9］造成的危害。家蠶在高溫、多濕、低質(zhì)飼料和飼養(yǎng)管理差等不良條件的沖擊下容易引起細(xì)菌性腸道?。?1］；低溫、多濕、葉子差等不良飼養(yǎng)管理則易引起濃核病。隨著抗BmNPV家蠶品種的應(yīng)用推廣，細(xì)菌性腸道病的發(fā)生更為普遍。本次試驗為能更好地區(qū)別濃核病和細(xì)菌性腸道病，主要通過從病蠶獲得病原為主要依據(jù)，再給家蠶添食病原輔以添食抗生素進(jìn)一步確診。在本次添毒試驗中，C 組的蠶兒發(fā)育情況表明，鹽酸環(huán)丙沙星可能對濃核病毒有一定的抑制作用，其相關(guān)的抑制機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。另外，5齡添食病原比4 齡添食發(fā)病慢、發(fā)病輕的情況可以看出，隨著蠶兒齡期的增長，蠶體抵抗力在不斷增強(qiáng)。試驗情況與發(fā)病蠶區(qū)5 齡3～4 d 暴發(fā)，病死蠶腐爛有所不同，原因可能是與養(yǎng)蠶季節(jié)、環(huán)境、飼養(yǎng)數(shù)量和感染齡期等有關(guān)。試驗經(jīng)過PCR分子檢測方法和感染試驗可確定該蠶病屬病毒病濃核病，為祥云縣蠶區(qū)的下一步蠶病防控提供依據(jù)。

3.2 建議

根據(jù)家蠶濃核病的發(fā)病規(guī)律及該病流行病學(xué)的特點，在防治時必須貫徹“預(yù)防為主，綜合防治”的方針，同時提高蠶農(nóng)防控意識，加強(qiáng)桑園科學(xué)管理與飼養(yǎng)管理。

3.2.1 增強(qiáng)蠶農(nóng)消毒防控意識，掌握科學(xué)的防治措施 BmDNV主要通過食下傳染［11］，蠶座中的垂直感染是造成濃核病蔓延的主要原因之一，BmDNV也可能通過病蠶尸體及蠶室土壤實現(xiàn)病毒的越冬，所以要強(qiáng)化“三消一洗”的消毒防病工作，各項具體操作要落實到位。養(yǎng)蠶前，做好蠶室、貯桑室、蠶具、蔟具、飼養(yǎng)區(qū)域的清洗及消毒，消滅越冬病原，切斷傳播途徑；養(yǎng)蠶結(jié)束后認(rèn)真搞好“回山”消毒，及時清理病死蠶尸體、蠶糞、及霉?fàn)€的蠶繭等，將蠶室、大小蠶具、蔟室蔟具等洗凈并徹底消毒，防止病原擴(kuò)散，有效降低病原越冬基數(shù)；蠶期要抓好眠起處理，注意觀察青頭蠶、遲眠蠶，發(fā)現(xiàn)病蠶，正確診斷，及時隔離淘汰病蠶，進(jìn)行蠶體蠶座消毒，防止蠶座傳染。建立和嚴(yán)格執(zhí)行經(jīng)常性的防病衛(wèi)生制度。加強(qiáng)蠶農(nóng)的消毒防病意識，促使其掌握消毒的技術(shù)要點，選擇有效的消毒藥物和科學(xué)的消毒方法。消毒方法如下［2］：①用2%甲醛溶液在25℃的環(huán)境溫度下保持濕潤狀態(tài)20 min；②用0.3%漂白粉溶液在23 ℃的環(huán)境溫度下保持3 min；③用0.5%石灰漿在23 ℃的環(huán)境溫度下保持3 min進(jìn)行消毒，均可滅活BmDNV或先用1%的新鮮石灰漿消毒再用含有效氯1%的漂白粉液或2%甲醛溶液進(jìn)行消毒能有效的抑制濃核病及其他蠶病的發(fā)生和傳播［12］。

3.2.2 加強(qiáng)桑園與飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)蠶兒體質(zhì) 首先因地制宜選擇桑樹品種，做好肥水管理，根據(jù)各齡期采摘適熟葉，保證蠶兒營養(yǎng)需求，加強(qiáng)蠶室內(nèi)氣象環(huán)境控制，創(chuàng)造適溫適濕的飼養(yǎng)環(huán)境；其次要做好小蠶共育，共育出強(qiáng)健無毒的小蠶；再次由于桑螟、桑卷葉蛾是BmDNV的健康帶毒者［13］，采取農(nóng)業(yè)防治與化學(xué)藥物相結(jié)合做好病蟲害防治，防止病原以桑葉作為媒介傳染家蠶。