李向群 ，韓菲 ，尹珊珊 ，鄧海清 ，劉建凱 ，袁波

1.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽110016；2.北京民海生物科技有限公司，北京102600

b 型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenza type b，Hib）為革蘭陰性莢膜型致病菌。在 6 種（a、b、c、d、e、f）莢膜型流感嗜血桿菌中致病力最強，可引起5 歲以下幼兒腦膜炎、肺炎及其他侵襲性疾病如敗血癥、會厭炎、心包炎等［1］。目前最有效的防范措施是注射Hib 結(jié)合疫苗。該疫苗是將Hib 精制多糖與載體蛋白共價結(jié)合得到T 細胞依賴抗原，激發(fā)嬰幼兒（≤2 歲兒童）、老人及免疫缺陷患者體內(nèi)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生免疫記憶，誘生免疫球蛋白IgG，較單純多糖疫苗誘生的IgM 更有效，且能維持較長時間，具有良好的保護力［2］。

Hib 精制多糖是Hib 結(jié)合疫苗的中間產(chǎn)品，分子大小是評價其質(zhì)量的重要指標，《中國藥典》三部（2020 版）通則3419 采用體積排阻法（size exclusion chromatography，SEC）測定Hib 精制多糖分子大小及分配系數(shù)（KD）值對應(yīng)保留體積的回收率（RX），該方法根據(jù)多糖分子在多孔性凝膠色譜柱中從大到小分離的原理，利用凝膠色譜柱的分子篩機制，采用AKTA 層析系統(tǒng)分離供試品，再用檢測器對分離出的物質(zhì)進行檢測，得到供試品在層析柱中的KD及相對分子質(zhì)量分布情況?！吨袊幍洹啡浚?020 版）規(guī)定Hib 精制多糖采用瓊脂糖CL-4B 凝膠柱檢測，KD≤ 0.5 的多糖 RX應(yīng)大于 50%［3］。

Hib 精制多糖屬天然水溶性高分子化合物，以微生物為原料通過物理化學(xué)方法提取獲得［4］。分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布是表征高分子物質(zhì)的最基本參數(shù)之一，也是高分子性能研究和生產(chǎn)過程中需控制的重要參數(shù)。通?？捎? 種分子質(zhì)量表示方式表征高分子分子質(zhì)量大?。簲?shù)均分子質(zhì)量（Mn）、重均分子質(zhì)量（MW）、Z 均分子質(zhì)量（M）z及黏均分子質(zhì)量（Mη）。一般來說，分子質(zhì)量不均一的高分子分子質(zhì)量Mz＞MW＞ Mη＞ Mn［5］。

本研究采用HPLC 法將體積排阻色譜（SEC）與18 角度靜態(tài)激光散射系統(tǒng)MALLS 聯(lián)用，通過激光照射樣品產(chǎn)生的散射光來描述供試品的分子特性并得到供試品準確的MW［6］，無需借助任何標準品或預(yù)設(shè)的標準曲線進行計算，且對供試品進行更準確、客觀的表征。該技術(shù)已被越來越廣泛地應(yīng)用于細菌性多糖相對分子質(zhì)量的測定，同時根據(jù)示差圖譜可對樣品的相對分子大小及回收率情況進行分析［7-8］。本方法中激光檢測器對大分子物質(zhì)敏感，容易產(chǎn)生響應(yīng)信號，而示差折光信號對樣品濃度敏感，這兩種檢測器可同時反應(yīng)樣品中各相對分子質(zhì)量組分的差異［9］。傳統(tǒng)SEC 法測定Hib精制多糖相對分子質(zhì)量是利用AKTA 層析系統(tǒng)，測試周期較長，一般需10 ～12 h，且僅能進行定性分析；而采用HPLC-MALLS 系統(tǒng)聯(lián)用方法測試，用時較短，一般1 h 內(nèi)完成，操作簡單、檢測效率高。

本研究采用HPLC-MALLS 系統(tǒng)測定Hib 精制多糖供試品的KD及RX，旨在與AKTA 層析系統(tǒng)測試結(jié)果進行對接，同時實現(xiàn)精制多糖MW的準確檢測。

1 材料與方法

1.1 供試品 9 批Hib 精制多糖（批號分別為1909-106、1909107、1911108、1911109、1911111、1912112 ～1912115）由北京民海生物科技有限公司制備及保存，各項質(zhì)量指標均符合《中國藥典》三部（2020版）要求。

1.2 主要試劑及儀器 維生素B12、牛血清白蛋白（BSA）及DNA（鮭魚睪丸脫氧核糖核酸鈉鹽）均購自美國Sigma 公司；藍色葡聚糖2000、AKTA pure150M層析系統(tǒng)、CL-4B Sepharose 瓊脂糖凝膠色譜柱（1.6 cm × 100 cm）、色譜柱管（16 ／ 100）購自美國GE 公司；AKTA 層析系統(tǒng)聯(lián)用的RID-20A 型示差儀及CL-20A 型HPLC 系統(tǒng)購自日本島津公司；DAWN HELEOS Ⅱ型18 角度靜態(tài)光散射分析系統(tǒng)MALLS ／R（I包括光散射儀和配套示差儀）購自美國Wyyat 公司；TSK G5000PWxl 色譜柱及 TSK PWXL Guard 保護柱購自日本TOSOH 株式會社。

1.3 色譜條件

1.3.1 AKTA 層析系統(tǒng) 采用CL-4B Sepharose 瓊脂糖凝膠色譜柱作為分離柱，0.15 mol ／ L 氯化鈉溶液為流動相，將 2 mg ／ mL 葡聚糖 2000 和 1 mg ／ mL維生素B12 按5 ∶1 的比例混合，采集波長為206 和280 nm 雙波長模式。流速為 0.3 mL ／ min，上樣體積為1 mL。以葡聚糖2000 保留體積為空流體積，維生素B12 保留體積為柱床體積。

1.3.2 HPLC-MALLS 系統(tǒng) 采用TSK G5000 PWxl色譜柱作為分離柱，0.15 mol ／ L 氯化鈉溶液為流動相，以0.1 mg ／ mL DNA 保留體積作為空流體積，1.5%氯化鈉溶液保留體積為柱床體積，采集示差信號，流速為 0.5 mL ／ min，上樣體積為 40 μL。

1.4 供試品處理及上樣檢測 取供試品適量，以流動相配制濃度為5 mg ／ mL Hib 精制多糖溶液，使用前經(jīng)0.2 μm 膜過濾。AKTA 層析系統(tǒng)和HPLC-MALLS系統(tǒng)上樣樣品為同1 管供試品，濃度為5 mg ／ mL，同日進行平行測試，記錄示差信號。

1.5 數(shù)據(jù)結(jié)果處理 HPLC-MALLS 系統(tǒng)以2 mg ／mL BSA 作歸一化分析，校準儀器，供試品檢測結(jié)果采用ASTRA 7.3 軟件進行歸一化處理，采用Debye Plot模型擬合曲線獲得MW。根據(jù)供試品檢測示差圖譜，按下式計算供試品的KD，利用系統(tǒng)自帶軟件計算KD值為 0.5 的 RX。

KD=（Ve - Vo）／（Vi - Vo）

式中Ve 為供試品保留體積；HPLC 系統(tǒng)中Vo為葡聚糖2000 出峰保留體積，Vi 為維生素B12 出峰保留體積；HPLC-MALLS 系統(tǒng)中Vo 為DNA 出峰保留體積，Vi 為氯化鈉出峰保留體積。合格標準：KD≤0.5，RX≥ 50%。

1.6 AKTA 層析系統(tǒng)與HPLC-MALLS 系統(tǒng)相關(guān)性分析 實驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007 軟件進行統(tǒng)計及分析，以AKTA 系統(tǒng)測得KD值為橫坐標，HPLC-MALLS系統(tǒng)測得KD值為縱坐標擬合線性回歸方程，計算相關(guān)系數(shù)r，以r ＞0.6 判定檢測結(jié)果相關(guān)，即兩種方法等效。

1.7 HPLC-MALLS 方法的驗證

1.7.1 重復(fù)性 9 批供試品采用HPLC-MALLS 系統(tǒng)均上樣 6 次，測定 MW、KD及 RX，并計算 RSD。接受標準：RSD ≤ 5%。

1.7.2 準確性 9 批供試品的上樣量均為200 μg（理論值），采用HPLC-MALLS 系統(tǒng)上樣6 次，計算Hib 精制多糖回收率（實測值占理論值的百分比）及RSD。接受標準：回收率≥70%。

1.7.3 定量限 檢測同批次濃度為0.5 和1.0 mg／mL的 Hib 精制多糖，以信噪比（S ／ N）≥ 10 且不確定度＜5%確定定量限。

2 結(jié) 果

2.1 Hib 精制多糖的KD及RX9 批供試品經(jīng)HPLC系統(tǒng)檢測，KD最大值為 0.37，RX最小值為 78%，經(jīng)HPLC-MALLS 系統(tǒng)檢測，KD最大值為 0.38，RX最小值為84%；兩者檢測結(jié)果均符合《中國藥典》要求，見表1。

表1 9 批供試品的AKTA 層析系統(tǒng)及HPLC-MALLS 系統(tǒng)檢測結(jié)果Tab.1 Determination results of nine batches of samples by AKTA chromatography system and HPLC-MALLS system

2.2 AKTA 層析系統(tǒng)與HPLC-MALLS 系統(tǒng)的相關(guān)性 KD值回歸方程為：Y = 0.903 X + 0.051，r 為0.978，表明檢測結(jié)果具有顯著相關(guān)性，兩種方法等效，見圖1。

圖1 兩種方法檢測的KD 值線性曲線Fig.1 Linear curve of KD values determined by two methods

2.3 HPLC-MALLS 方法的驗證

2.3.1 重復(fù)性 結(jié)果顯示，9 批供試品MW為（1.390 ～2.341）× 105g ／ moL，MW、KD及 RX平行間的 RSD均≤3.8%，見表2。表明方法重復(fù)性良好。

2.3.2 準確性 結(jié)果顯示，9 批供試品檢測6 次多糖回收率為 80% ～ 87%，RSD 為 0.05% ～ 3.43%，見表3。表明方法準確性良好。

2.3.3 定量限 0.5 及 1 mg ／ mL Hib 精制多糖的S ／ N 分別為 35 和 62；0.5 mg ／ mL Hib 精制多糖的不確定度 ＞ 5%，不可信度較高，1 mg ／ mL Hib 精制多糖不確定度＜5%，可信度較高。見表4。確定定量限為 1 mg ／ mL。

表 2 9 批供試品 HPLC-MALLS 系統(tǒng)檢測6 次的 KD 值、RX 及MWTab.2 KD，RX and MW values of nine batches of samples in six tests by HPLC-MALLS system

表3 HPLC-MALLS 系統(tǒng)準確性驗證Tab.3 Verification for accuracy of HPLC-MALLS system

表4 不同濃度Hib 精制多糖測試結(jié)果Tab.4 Determination results of purified HIb polysaccharide at various concentrations

3 討 論

HPLC-MALLS 是利用SEC 色譜分離系統(tǒng)將供試品中的組分按尺寸大小依次洗脫進入MALLS 系統(tǒng)進行分析，激光照射的樣品會在各方向產(chǎn)生散射光，光散射強度與MW及溶液的濃度成正比，散射光角度變化與分子尺寸大小相關(guān)［10］。

AKTA 層析系統(tǒng)檢測9 批供試品的KD為0.29 ～0.37，HPLC-MALLS 系統(tǒng)檢測的 KD為 0.31 ～ 0.38，兩系統(tǒng)KD值進行線性擬合得后，r 為0.978，表明兩種方法測定Hib 精制多糖相對分子大?。↘D值）時結(jié)果相關(guān)性顯著，方法間具有等效性。

9 批次供試品經(jīng)HPLC-MALLS 系統(tǒng)重復(fù)測試6次，MW、KD及 RX重復(fù)性結(jié)果的 RSD 均小于 5%，表明重復(fù)性良好。由于Hib 精制多糖的濃度較高，糖溶液體系較為黏稠，導(dǎo)致多糖回收率較低，最高值僅為87%，這可能是供試品與色譜柱的相互作用造成的。在后續(xù)驗證工作中將進行深入研究。

SEC-MALLS 系統(tǒng)在實際測試高分子物質(zhì)的MW時，會有多重因素影響結(jié)果的不確定度，如色譜柱類型、流動相組成、流速、柱溫、樣品處理、進樣體積、折光指數(shù)增量（dn ／ dc）等。在同等條件下選取不同濃度供試品測試，選擇更低的不確定度對應(yīng)的數(shù)據(jù)作為表征供試品相對分子質(zhì)量的結(jié)果。常采用S ／ N法確定供試品中定量限，一般以S ／ N ≥ 10 對應(yīng)濃度確定［11］。本研究結(jié)果顯示，Hib 精制多糖檢測的S ／ N 達60 以上才能達到不確定度相對較低（即結(jié)果可信度高）的定量要求。因此，對于不同的制品可能需不同的S ／ N 確定其定量限。

綜上所述，生物大分子的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象能影響其生物學(xué)功能［11］，Hib 精制多糖相對分子質(zhì)量及分子大小測試結(jié)果能間接反應(yīng)其結(jié)構(gòu)，因此，檢測方法的準確、可靠是疫苗產(chǎn)品質(zhì)量的重要保證。HPLC-MALLS系統(tǒng)檢測Hib 精制多糖與AKTA 層析系統(tǒng)相比更適用于測試Hib 精制多糖的MW、KD及RX，可作為Hib精制多糖分子大小分布檢測的改良方法，通過數(shù)據(jù)不斷積累和補充，下一步將進行更多方面的方法學(xué)研究及驗證。