孟子延，馬丹婧 綜述，高雪，李琦涵 審校

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明650118

1989 年,美國VICAL 公司首次將人工合成的RNA作為新型藥物用于治療腫瘤等疾?。?］；1990 年,有研究將裸mRNA 肌肉注射小鼠后,實(shí)現(xiàn)了相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)［2］,證明體外轉(zhuǎn)錄(in vitro transcribed,IVT)mRNA 可傳遞遺傳信息,從而在機(jī)體組織內(nèi)表達(dá)蛋白質(zhì)。mRNA 疫苗是將含有編碼抗原蛋白的mRNA導(dǎo)入人體,直接進(jìn)行翻譯,形成相應(yīng)的抗原蛋白,從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,達(dá)到預(yù)防免疫的作用。mRNA 疫苗是繼滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗和病毒載體疫苗后的第三代疫苗,該疫苗具有針對(duì)病原體變異反應(yīng)速度快、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、易規(guī)?；a(chǎn)和安全有效性高等特點(diǎn)。研究表明,mRNA疫苗可誘導(dǎo)動(dòng)物模型產(chǎn)生針對(duì)寨卡(Zika Virus)、埃博拉(Ebola virus)和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的免疫反應(yīng)［3-7］。針對(duì)腫瘤的個(gè)性化人體試驗(yàn)證明,患者可對(duì)mRNA 疫苗產(chǎn)生 CD4+T 和 CD8+T 細(xì)胞應(yīng)答［8］。

mRNA 疫苗在預(yù)防各類傳染病過程中發(fā)揮了重要作用。由重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒病(Corona Virus Disease 2019,COVID-19)正在全球蔓延,給人類生命健康和社會(huì)穩(wěn)定帶來了嚴(yán)重影響,接種疫苗是控制疫情暴發(fā)和病毒傳播的有效手段［9-10］。截至2021 年2 月26 日,全球已有6 家公司或機(jī)構(gòu)設(shè)計(jì)的mRNA 疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段,其中美國Biotech 公司與Pfeizer 公司等聯(lián)合研發(fā)的 mRNA 疫苗 BNY162［11］和 Moderna 及Pfeizer 公司研發(fā)的 MRNA-1273［12］均顯示出了良好的安全性和有效性,已獲緊急使用批準(zhǔn)。本文就mRNA 疫苗的免疫學(xué)特性、分子設(shè)計(jì)、遞送系統(tǒng)、安全性的研究進(jìn)展及其相應(yīng)機(jī)制作一綜述。

1 mRNA 疫苗的免疫學(xué)特性

抗原編碼mRNA 可直接引發(fā)MHC-Ⅰ的呈現(xiàn)和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反應(yīng),這是mRNA 疫苗的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)之一。mRNA 允許抗原在細(xì)胞質(zhì)中瞬時(shí)表達(dá)和積聚,隨后這些抗原可被高效加工成多肽,并裝載至MHC-Ⅰ類通路中。因此,胞漿中存在少量mRNA 就可確保將廣泛的抗原提呈至CTL 細(xì)胞。MHC-Ⅱ類通路也可用mRNA 作為抗原來源,在mRNA 表達(dá)的蛋白分泌和循環(huán)后,直接將抗原從細(xì)胞質(zhì)穿梭至溶酶體,也可在mRNA 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)中加入溶酶體靶向序列［13］。

研究表明,mRNA 傳遞可觸發(fā)樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)的抗病毒激活狀態(tài),其機(jī)制可能是涉及位于核內(nèi)體的清道夫受體7(Toll-like receptor 7,TLR7)和 TLR8 識(shí)別單鏈 RNA［14］。通過 RNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成或在IVT mRNA 生成過程中引入雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)片段污染物,免疫激活可通過核內(nèi)體的TLR3 途徑激發(fā)；除了TLRs,dsRNA 還可激活胞質(zhì)RNA 傳感器視黃酸誘導(dǎo)基因Ⅰ(retinoic acid inducible geneⅠ,RIGⅠ)和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5)［15-17］。mRNA 分子結(jié)合這些危險(xiǎn)信號(hào)傳感器后,將通過特定的適配分子(如TLR7／8 的MyD88 分子和TLRs 的TRIF 分子)使信號(hào)分子下調(diào),導(dǎo)致Ⅰ型干擾素(interferons-Ⅰ,IFNs-Ⅰ)和其他促炎因子,如白介素-6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的產(chǎn)生；IFNs-Ⅰ結(jié)合自分泌和旁分泌受體,激活Janus 激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase-signal transducer activator of transcription,JAK-STAT)通路,該通路可調(diào)節(jié)數(shù)百種參與抗病毒免疫蛋白基因的表達(dá)［18-19］。這些信號(hào)通路協(xié)調(diào)不同的先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的激活和促進(jìn),被稱為mRNA 的“自佐劑效應(yīng)”。

2 mRNA 疫苗的分子設(shè)計(jì)原理

IVT mRNA 的基本結(jié)構(gòu)與真核mRNA 較相似,包括1 個(gè)蛋白編碼的開放閱讀框(open reading frame,ORF)及其兩側(cè)的5′和 3′非翻譯區(qū),即 5′末端的 1 個(gè)7-甲基鳥苷帽子結(jié)構(gòu)和 3′端的 1 個(gè) 100 ～ 250 bp 的poly(A)尾巴。非編碼結(jié)構(gòu)特征在mRNA 的藥理作用中起著重要作用,可進(jìn)行單獨(dú)優(yōu)化,以調(diào)節(jié)mRNA 的穩(wěn)定性、翻譯效率和免疫原性［20-21］。

2.1 mRNA 中核苷酸類似物的設(shè)計(jì) mRNA 核苷酸自然發(fā)生的翻譯后修飾在一定程度上阻止了內(nèi)源性mRNA 的免疫監(jiān)測(cè),使細(xì)胞能夠區(qū)分內(nèi)源性mRNA與病理性或入侵性mRNA。這為mRNA 疫苗的開發(fā)提供了新的思路,即通過合并修飾核苷來降低免疫刺激的產(chǎn)生,因此也提高了安全性。IVT mRNA 中用假尿苷替代鳥苷可降低2′-5′-寡腺苷酸合成酶的活性,該酶可通過RNaseL 酶調(diào)節(jié)mRNA 的切割；另外,與mRNA 翻譯過程抑制相關(guān)的蛋白激酶R 活性較低,使 mRNA 的表達(dá)增強(qiáng)。KORMANN 等［22］研究表明,用加入25%硫脲苷和25%的5-甲基胞苷進(jìn)行核苷修飾mRNA,其編碼促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)2 周后,產(chǎn)生的EPO 水平提高了5 倍；未修飾的mRNA 編碼的EPO 水平未發(fā)生顯著變化,僅引發(fā)了實(shí)質(zhì)性的免疫激活。使用核苷類似物合成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的大部分TLRs 均不再被激活,有研究表明,使用核苷類似物后,mRNA 翻譯效率增加或穩(wěn)定性升高的同時(shí),免疫原性有所降低［23-24］。

2.2 5′和 3′端非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTRs)的設(shè)計(jì) 除了加入核苷類似物之外,優(yōu)化mRNA 的ORF 和UTRs 序列,如豐富GC 含量或選擇長(zhǎng)壽mRNA分子的UTRs,也可強(qiáng)化mRNA 的表達(dá),增加mRNA的翻譯能力和穩(wěn)定性［25-27］。mRNA 的 5′和 3′UTRs 可顯著影響mRNA 的轉(zhuǎn)譯率和半衰期,因此優(yōu)化UTRs可能是提高mRNA 轉(zhuǎn)譯率和延長(zhǎng)mRNA 半衰期的有效途徑［28-31］。有文獻(xiàn)報(bào)道,由于穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)可能阻礙核糖體結(jié)合起始編碼復(fù)合物,5′UTRs 區(qū)域必須短而松散［32］。有研究使用一個(gè)基于細(xì)胞培養(yǎng)的系統(tǒng)過程來識(shí)別新的UTRs,顯著增加了IVT mRNA的蛋白表達(dá)［33］。與人類 β-珠蛋白 3′UTRs 比較,有些3′UTRs 序列可誘導(dǎo)產(chǎn)生約高3 倍的蛋白。研究表明,與攜帶 β-珠蛋白 3′UTRs 的 mRNA 比較,攜帶新3′UTRs 基序的mRNA 疫苗在接種和基因重編譯研究中可誘導(dǎo)更有效的治療效果［33］。

2.3 Cap 結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì) mRNA 的Cap 結(jié)構(gòu)與其穩(wěn)定性密切相關(guān),Cap 結(jié)構(gòu)通過與真核翻譯起始復(fù)合因子eIF4E結(jié)合,從而調(diào)節(jié)mRNA 翻譯效率。加Cap 結(jié)構(gòu)后mRNA 5′端缺失末端游離磷酸基團(tuán),對(duì)堿性磷酸酶較穩(wěn)定,且Cap 結(jié)構(gòu)能夠封閉磷酸酯鍵上游離的2′OH 基團(tuán),從而對(duì)部分 RNA 酶(T2、T1、A)較穩(wěn)定?？狗崔D(zhuǎn)帽(anti-reverse cap,ARCA)修飾可確保5′末端的正確定位,產(chǎn)生幾乎完整的mRNA 片段,從而有效結(jié)合核糖體［34］。其他Cap 修飾,如硫代磷酸Cap類似物,可進(jìn)一步提高與起始因子eIF4E 的親和力,增加對(duì)RNA 脫帽復(fù)合物的抗性［35-36］。傳統(tǒng)加Cap 的方法為酶加帽法(在制造過程中添加額外的反應(yīng)組合純化步驟)［37］及與Cap0 共轉(zhuǎn)錄加帽法(該方法有可能導(dǎo)致dsRNA 的產(chǎn)生,從而激活先天性免疫)［38］。CleanCap?在IVT 期間向特定的轉(zhuǎn)錄起始序列添加了一個(gè)自然的 5′Cap1 結(jié)構(gòu)［39］,使一步法生產(chǎn) mRNA疫苗成為可能。

2.4 Poly(A)尾的設(shè)計(jì) 3′端Poly(A)尾是除了5′端Cap 結(jié)構(gòu)外對(duì)mRNA 穩(wěn)定性起重要作用的結(jié)構(gòu),mRNA 的降解大多數(shù)從Poly(A)尾端開始,先將Poly(A)尾結(jié)構(gòu)經(jīng)脫腺苷化作用縮短為寡A 尾,再通過一系列反應(yīng)除去5′端Cap 結(jié)構(gòu),從而完成核糖核酸外切酶對(duì)mRNA 的降解。mRNA 的Poly(A)尾的伸長(zhǎng)與表達(dá)持續(xù)時(shí)間相關(guān),研究表明,3′UTR 的特異性修飾可通過影響脫腺苷率而減緩Poly(A)尾的衰變［40-41］。通過將基因片段上加尾巴序列的方法在mRNA 分子上添加Poly(A)尾,也可利用Poly(A)尾的多聚酶在IVT 后延伸mRNA 分子進(jìn)行加尾。前者具有確定的長(zhǎng)度,潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)較小,是疫苗開發(fā)更好的選擇［42］。據(jù)報(bào)道,Poly(A)尾長(zhǎng)度的增加可提高形成多聚體的幾率,最適宜的Poly(A)尾長(zhǎng)度位于120 ～150 bp 之間［43-45］。

3 mRNA 疫苗的遞送系統(tǒng)

mRNA 疫苗原位靶向抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells,APC)有許多優(yōu)點(diǎn),但將mRNA 輸送至靶細(xì)胞尚需克服諸多技術(shù)障礙。裸mRNA 疫苗能夠成功表達(dá),但易受酶的影響,發(fā)生降解,采用納米載體制備的mRNA 可更好地抵御酶降解,使靜脈注射等新的遞送途徑成為可能［46-48］。脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles,LNPs)是目前最先進(jìn)的遞送系統(tǒng),在siRNA的傳遞中證明是安全有效的［49-50］,近期的新冠疫苗大規(guī)模臨床試驗(yàn)表明,LNPs 作為mRNA 的遞送載體,其安全性和遞呈效果較理想［9-10］。

3.1 LNPs 遞送系統(tǒng)的研究策略 經(jīng)mRNA 遞送測(cè)試的脂質(zhì)配方通常由陽離子／ 離子化脂質(zhì)和其他輔助脂質(zhì)(如磷脂、膽固醇和 ／ 或聚乙二醇脂質(zhì))組成。陽離子類脂類用于負(fù)電荷mRNA 分子的靜電絡(luò)合,輔助脂質(zhì)由于其獨(dú)特的功能特性可能會(huì)影響復(fù)雜的mRNA LNPs 的結(jié)構(gòu)排列,從而提高其穩(wěn)定性和促進(jìn)mRNA LNPs 的細(xì)胞內(nèi)攝取和胞質(zhì)進(jìn)入［51］。細(xì)胞內(nèi)吞的mRNA LNPs 在核內(nèi)體降解是影響整體轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素之一。有研究表明,mRNA 的核內(nèi)體釋放機(jī)制依賴于LNPs 的質(zhì)子化(即電離)脂質(zhì)和核內(nèi)體膜的陰離子磷脂混合步驟［52］。這些脂質(zhì)間離子對(duì)的形成會(huì)引發(fā)膜融合和膜失穩(wěn),反而增強(qiáng)了mRNA 分子從核內(nèi)體的逃逸。

另一種mRNA LNPs 的產(chǎn)生策略是乙醇稀釋,這是一種適用于制備更先進(jìn)的含電離性脂質(zhì)LNPs 體系的方法。將單個(gè)脂質(zhì)溶解在乙醇中,在酸性緩沖液中可與mRNA 快速混合,通過稀釋乙醇相,脂質(zhì)進(jìn)行縮合過程,形成LNPs 的同時(shí)有效地包裹mRNA。隨后的滲析步驟進(jìn)行中和緩沖液,以去除乙醇和中和pH。研究發(fā)現(xiàn),通過調(diào)節(jié)不同脂質(zhì)的摩爾比,形成具有多種不同表面特征的mRNA LNPs,利于D-Lin-MC3-DMA 脂質(zhì)(pH 依賴的電離性脂類)從內(nèi)核至表面部分分離的LNPs 組分與提高轉(zhuǎn)染效率有關(guān)［53］。

3.2 mRNA LNPs 的體內(nèi)轉(zhuǎn)染 膜融合理論的研究已有十幾年的歷史,但LNPs 促進(jìn)mRNA 胞漿的傳遞機(jī)制尚未明確［54］。近期研究表明,mRNA LNPs 的內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程,涉及到的機(jī)制包括mRNA進(jìn)入胞漿和翻譯的循環(huán)通路及信號(hào)通路,如位于晚期內(nèi)溶酶體上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Niemann-Pick C-1 型,其負(fù)責(zé)大量?jī)?nèi)化(si)RNA-LNPs 的胞吐,大幅降低了胞質(zhì)傳遞,雷帕霉素復(fù)合物1 的機(jī)械靶點(diǎn)向溶酶體膜募集是觸發(fā)所傳遞mRNA 翻譯的關(guān)鍵［55］。細(xì)胞進(jìn)入機(jī)制和細(xì)胞內(nèi)mRNA 轉(zhuǎn)運(yùn)之間關(guān)系的研究較少,但該項(xiàng)研究較重要。有研究表明,通過靶向mRNA LNPs至DCs 表達(dá)的選擇性表面受體,可將顆粒引導(dǎo)至對(duì)mRNA 遞送降解程度較低細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸途徑上［56］。

4 mRNA 疫苗的安全性

mRNA 疫苗除了具有DNA 疫苗能夠胞內(nèi)表達(dá)抗原的優(yōu)點(diǎn)外,還克服了其免疫原性低、可能產(chǎn)生抗載體免疫的缺點(diǎn),且無整合進(jìn)宿主DNA 的風(fēng)險(xiǎn)。但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)mRNA 疫苗的自佐劑效應(yīng)可能帶來潛在的安全性風(fēng)險(xiǎn)。IFNs-Ⅰ參與免疫耐受調(diào)節(jié),可促進(jìn)自身反應(yīng)性B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的發(fā)育,對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)構(gòu)成威脅［57-58］。前期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),受試志愿者中自身免疫常見診斷指標(biāo)升高的比例達(dá)20%［59］,也出現(xiàn)了與自身免疫病有關(guān)的貝爾氏麻痹(一種暫時(shí)性面癱)病例［60］,如注射 BNT162b2［61］。這種IFNs-Ⅰ信號(hào)生產(chǎn)的影響與mRNA 疫苗設(shè)計(jì)的相關(guān)性尚需進(jìn)一步研究。

5 小結(jié)與展望

隨著研究的不斷深入,mRNA 疫苗技術(shù)已日趨成熟。有證據(jù)表明,mRNA 疫苗的保護(hù)效果［9-10］優(yōu)于同種病毒的滅活疫苗［62-64］、亞單位疫苗［65-66］和病毒載體疫苗［67-69］。目前,LNPs 用于 mRNA 的局部和全身傳遞已成為一種趨勢(shì),其中跨越細(xì)胞內(nèi)外屏障的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究,有望實(shí)現(xiàn)有針對(duì)性地提高mRNA 的整體轉(zhuǎn)染能力。在遭遇突發(fā)新發(fā)傳染病時(shí),mRNA 疫苗能迅速實(shí)現(xiàn)從研發(fā)到生產(chǎn)的目的,當(dāng)其安全性和有效性指標(biāo)符合法規(guī)監(jiān)管要求時(shí),將是一種良好的應(yīng)急選擇,可及時(shí)保護(hù)易感人群。雖然有mRNA疫苗相關(guān)的貝爾氏麻痹的報(bào)道,但發(fā)生幾率極低；另外,mRNA 疫苗大規(guī)模用于人體的時(shí)間尚短,需進(jìn)行長(zhǎng)期不良反應(yīng)監(jiān)測(cè),以驗(yàn)證其安全性及有效性。