武太勇，李 健，付海軍，程才統(tǒng)，呂 智，馮 毅

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨科，山西太原 030001）

骨肉瘤起源于間葉細(xì)胞，是一種最常見于10～30 歲人群中的原發(fā)骨惡性腫瘤疾病，多見于長骨干骺端，具有侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)。目前，骨肉瘤治療的方法主要包括手術(shù)配合放化療，但存在復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等問題［1］。骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制尚未明確。骨肉瘤的早期診斷對患者的預(yù)后至關(guān)重要，但早期診斷卻相對局限，主要包括影像學(xué)檢查和血清生化等檢測，并且其特異性和敏感度普遍不高。

DNA 甲基化因其穩(wěn)定性且易于定性或定量檢測，是早期發(fā)現(xiàn)癌癥的一個重要診斷指標(biāo)。甲基化是表觀遺傳改變的重要方式，在多種癌癥中能夠發(fā)現(xiàn)異常的DNA 甲基化［2，3］。DNA 甲基化是指在DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′C 位的共價鍵結(jié)合一個甲基基團(tuán)；DNA 甲基化是基因表達(dá)調(diào)控、基因沉默和選擇性基因剪接的重要機(jī)制之一，是癌基因激活和抑癌基因失活的重要原因之一［4，5］。 其作用機(jī)制分為兩種：一種是甲基化后的DNA 不被某些轉(zhuǎn)錄因子識別，所以無法結(jié)合到該基因的啟動子，從而引起轉(zhuǎn)錄抑制；另一種是甲基化后的DNA 召集甲基化結(jié)合蛋白，使該基因的啟動子區(qū)發(fā)生甲基化，進(jìn)而引起目的基因轉(zhuǎn)錄失活?？梢姡珼NA 甲基化在癌癥早期發(fā)揮重要作用。因此，本文綜述骨肉瘤相關(guān)基因甲基化，為闡明骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與耐藥機(jī)制提供新的方向，同時為骨肉瘤的早期診斷、預(yù)后預(yù)測、研究靶向藥物治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 PTEN 基因甲基化與骨肉瘤

第10 號染色體缺失的同源性磷酸酶-張力蛋白（phosphataseand tensin homolog，PTEN）是常見的腫瘤抑制基因之一，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的因子，其特征主要與本身脂質(zhì)磷酸酶活性有關(guān)；骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展與PTEN的下調(diào)有關(guān)［6，7］。PTEN調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡主要通過以下三種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用：（1）PI3K/AKT 信號通路；（2）MAPK 通路；（3）FAK 通路。同時，PTEN能夠提高caspase-3、7、9 活性，從而誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥中PTEN基因發(fā)生甲基化，導(dǎo)致PTEN表達(dá)缺失，從而加速腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，如：骨肉瘤、宮頸癌、膀胱癌等［7-9］。 Song 等［10］將甲基化抑制劑5-Zac 加入MG-63 骨肉瘤細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)mRNA 表達(dá)水平增加，PTEN的表達(dá)水平增加，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，同時PTEN的甲基化水平降低，且隨著5-Zac 濃度的增加，PTEN表達(dá)和mRNA 轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，細(xì)胞凋亡率也與5-Zac 濃度呈正相關(guān)。Wang 等［11］同樣證實了骨肉瘤中PTEN因甲基化導(dǎo)致表達(dá)降低，同時開發(fā)了亞硒酸鹽取代羥基磷灰石納米粒子（selenite-substituted hydroxyapatite ，SeHA），利用離子取代理論，采用共沉淀方法得到納米級的SeHA 晶體，將晶體與細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SeHA 能夠明顯抑制細(xì)胞存活，存活率下降（58.90±14.37）%，而HA 的抑制作用稍弱，細(xì)胞存活率僅下降（11.58±9.33）%。在骨肉瘤裸鼠模型中，該顆粒能顯著抑制骨肉瘤復(fù)發(fā)，從而延長生存期。雖然并未發(fā)現(xiàn)SeHA 納米顆粒對PTEN有去甲基作用，卻證明了HA 可以提高該基因的甲基化水平，從而降低了PTEN的表達(dá)，提示摻雜亞硒酸根離子對PTEN基因具有去甲基化作用。綜上，可以認(rèn)為PTEN基因甲基化與骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡密切有關(guān)，PTEN甲基化能夠影響PTEN的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而影響PTEN基因參與的信號通路對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖。在去甲基化處理后，能夠去除部分甲基化位點(diǎn)的甲基，使PTEN發(fā)生去甲基化，能夠一定程度上恢復(fù)其抑癌作用。因此，將含有SeHA 的生物材料應(yīng)用于骨肉瘤患者是一項比較有意義的發(fā)現(xiàn)。

2 Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因甲基化與骨肉瘤

Wnt 信號通路與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關(guān)，是一條復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)。目前認(rèn)為，Wnt 信號通路主要有以下3 個分支：（1）經(jīng)典Wnt 信號通路，即Wnt/β-cantenin 信號通路；（2）Wnt/PcP 通路（planner cell polarity pathway）；（3）Wnt/Ca2+通路。多種癌基因和抑癌基因通過調(diào)控Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展。

2.1 APCDD1 基因甲基化與骨肉瘤

結(jié)腸腺瘤樣息肉下調(diào)蛋白1（adenomatosis polyposis coli down-regulated 1，APCDD1）是一種與Wnt 途徑相關(guān)的膜蛋白，是Wnt/β-cantenin 信號通路的抑制劑，其本身受β-cantenin 轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，APCDD1 在結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌和腎母細(xì)胞瘤等疾病中異常表達(dá)［12］。Han 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤組織的APCDD1啟動子區(qū)域的DNA 甲基化水平明顯高于鄰近正常組織，且表達(dá)明顯低于正常組織；在骨肉瘤細(xì)胞系中，APCDD1啟動子區(qū)的DNA甲基化同樣顯著高于成骨細(xì)胞。在給予去甲基化處理后，APCDD1的表達(dá)恢復(fù)，發(fā)揮抑癌作用。根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，APCDD1的過表達(dá)能夠使下游靶基因E-Cadherin，c-Myc和cyclinD1的表達(dá)均降低，從而負(fù)調(diào)控Wnt 信號通路，同時APCDD1能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞上皮間充實轉(zhuǎn)換和轉(zhuǎn)移。APCDD1的異常表達(dá)在多種腫瘤中存在，APCDD1甲基化在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，為骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制的研究提供一種方向。

2.2 Wnt5a 基因甲基化與骨肉瘤

Wnt5a 是研究最廣泛的Wnt 家族Wnt 蛋白之一，在各種器官的發(fā)育過程和產(chǎn)后細(xì)胞功能中起著重要的作用。它是一種分泌性糖蛋白，根據(jù)細(xì)胞受體環(huán)境，與Fz 和Ror 1/2 受體結(jié)合，導(dǎo)致Wnt 信號通路發(fā)生抑制或激活。 Wnt5a 通過非典型Wnt RhoA/Rac 或鈣（Ca2+）信號通路參與細(xì)胞的調(diào)節(jié)，Wnt5a 在多種癌癥疾病中發(fā)現(xiàn)被錯誤調(diào)節(jié)［14］。Vaidya 等［15］認(rèn)為Wnt5a 因具有不同亞型蛋白，所以對通路發(fā)揮激活或抑制具有不同的表現(xiàn)。Wnt5a基因通過選擇性剪接和不同的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)錄本。目前，已有8 個人類Wnta 轉(zhuǎn)錄本，其中有3個能夠產(chǎn)生完整的蛋白。實驗發(fā)現(xiàn)，與正常成骨細(xì)胞相比，骨肉瘤SaOS-2 和U2OS 細(xì)胞中Wnt5a啟動子B 活性降低，且在Wnt5a啟動子B 的CpG 區(qū)發(fā)現(xiàn)了甲基化。經(jīng)過甲基化抑制劑5-Zac 處理后，SaOS-2 細(xì)胞的啟動子B 被活化。綜合上述，研究表明，Wnt5a亞型B 作為抑癌因子在Wnt 信號通路中發(fā)揮重要的抑制作用，調(diào)控著骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展，是骨肉瘤中一個比較有指導(dǎo)意義的抑癌基因。Wnt5a啟動子B 活性降低是由DNA 甲基化與組蛋白共同作用所致。國內(nèi)外對此基因研究較少，仍有很大的研究空間。Wnt5a作為Wnt 信號通路上重要的抑癌基因，后續(xù)不論是應(yīng)用于診斷還是治療的道路仍漫長。

2.3 SFRP2 基因甲基化與骨肉瘤

分泌型卷曲相關(guān)蛋白（secreted frizzled-related proteins，SFRPs）是一種能夠抑制Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的蛋白，通過經(jīng)典和非經(jīng)典途徑負(fù)調(diào)控Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［16］。截至目前，已檢測到有5 種人類SFRPs，它們都擁有一個富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（CRD），用以與Wnt 配體結(jié)合。近年來，越來越多的證據(jù)證明SFRP2是一種腫瘤抑制基因，SFRP2的高甲基化及其低表達(dá)與多種腫瘤疾病相關(guān)，例如前列腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌、胃癌等［17］。Xiao 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤標(biāo)本中SFRP2表達(dá)降低且基因啟動子區(qū)甲基化增加，在骨肉瘤細(xì)胞中使用甲基化抑制劑5-Zac 處理之后，觀察到SFRP2發(fā)生去甲基化，且基因恢復(fù)表達(dá)，并且能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲作用。同時，發(fā)現(xiàn)能夠抑制β-catenin 在骨肉瘤細(xì)胞中的核保留。結(jié)合上述研究，SFRP2與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其主要是通過負(fù)調(diào)控Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是Wnt 信號通路激活拮抗劑；甲基化使其失活，在經(jīng)過去甲基化處理后，能夠恢復(fù)SFRP2的抑癌作用，其可以作為治療的靶點(diǎn)之一，能夠為藥物的研究提供理論依據(jù)。然而，由于缺少體內(nèi)實驗驗證，因此需要進(jìn)一步的深入研究。

2.4 miR-370 甲基化與骨肉瘤

FOXM1（forkhead box protein m1）是FOX 家族的一員，其主要功能是作為轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、細(xì)胞周期進(jìn)程、DNA 損傷修復(fù)以及凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。FOXM1 參與MAPK 通路和Wnt/β-catenin 通路，F(xiàn)OXM1 能夠與β-catenin 相互作用，并促使后者核定位，且當(dāng)FOXM1-β-catenin 復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核時，能夠進(jìn)一步與T 細(xì)胞因子（Tcf）或淋巴增強(qiáng)因子（Lef）形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，進(jìn)而激活c-myc和cyclinD1等Wnt 靶基因的表達(dá)［19］。許多microRNAs 在骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，例如：miR-17-5p、miR-26a-5p、miR-34a、miR-135b、miR-150 和miR-203 等［20-24］。根據(jù)它們在骨肉瘤疾病中發(fā)揮作用不同，將其分為致癌miRNAs 和抑癌miRNAs。例如，在骨肉瘤細(xì)胞中，miR-34a 和miR-203 表達(dá)減少，發(fā)揮腫瘤抑制作用；相反，miR-135b 和miR-150 在骨肉瘤樣本中過表達(dá)，發(fā)揮致癌作用［23，24］。包括miR-33b、miR-124a 和miR-127 在內(nèi)的幾種抑癌miRNAs 可以被DNA 甲基化修飾，從而導(dǎo)致在不同癌癥疾病中表達(dá)下調(diào)；miR-370 能夠直接靶向FOXM1 的3′非翻譯區(qū)，從而抑制其表達(dá)［25］。Zhang 等［26］證實，在骨肉瘤細(xì)胞中miR370 因DNA 甲基化表達(dá)降低，導(dǎo)致FOXM1 過表達(dá)，最終使骨肉瘤細(xì)胞中的Wnt/β-catenin 信號激活。使用甲基化抑制劑AZA 能夠顯著抑制FOXM1 的表達(dá)，提示miR-370 表達(dá)降低是因為DNA 甲基化所致。由此可知，miR-370 作為Wnt 信號通路重要的關(guān)鍵因素，甲基化使其低表達(dá)，去甲基化處理后使其恢復(fù)表達(dá)發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，深入研究此靶點(diǎn)對骨肉瘤治療具有重要意義。

2.5 WIF-1 基因甲基化與骨肉瘤

WIF-1（Wnt inhibitory factor-1）是Wnt 家族的成員之一，是Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑，能夠與WNTS 結(jié)合，從而阻斷WNTS 與受體蛋白復(fù)合相結(jié)合，阻斷經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［27］。段飛等［28］證實在骨肉瘤中Wnt-1 的啟動子區(qū)域發(fā)生甲基化，在給予裸鼠動物模型加入5-氮雜-2'-脫氧胞苷去甲基化處理后WIF-1表達(dá)增高，重新抑制腫瘤。充分說明，WIF-1的甲基化是參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制之一，WIF-1通過經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt 信號通路發(fā)揮作用，去甲基化能夠重新使其發(fā)揮抑癌作用，這為骨肉瘤機(jī)制的研究提供豐富的內(nèi)涵。

3 ARHI 基因甲基化與骨肉瘤

ARHI又稱為DIRAS3（GTP-binding protein Di-Ras3），是Ras 超家族中的一員，是一種腫瘤抑制基因?，F(xiàn)已證實，ARHI表達(dá)的缺失與多種腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［29］。有研究證實，ARHI基因甲基化能夠抑制其表達(dá)及活性，多種癌癥中ARHI的表達(dá)缺失是因為DNA 發(fā)生甲基化而引起下調(diào)，ARHI甲基化可能參與惡性腫瘤的發(fā)病過程［30］。Ye等［31］研究發(fā)現(xiàn)，與正常樣本比較，骨肉瘤細(xì)胞中ARHI基因的表達(dá)明顯降低，ARHImRNA 的表達(dá)也明顯減少，其啟動子區(qū)域發(fā)生了明顯甲基化。Zebularine 是一種新型去甲基化藥物，其成分為胞苷類似物，與5-氮雜-20-脫氧胞苷等其他DNA 甲基化抑制劑不同，Zebularine 在體內(nèi)和體外有較高的穩(wěn)定性和較低的毒性，并且Zebularine 能夠抑制ARHI甲基化，從而促進(jìn)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡［31］。綜上，ARHI基因是一種抑癌基因，在骨肉瘤中發(fā)揮重要作用，因甲基化而失活，從而促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生；5-氮雜-20-脫氧胞苷具有藥物毒性，在使用方面有一定的局限性；目前，Zebularine 在細(xì)胞實驗中已充分證實其作用，但尚未在體內(nèi)實驗中驗證，期待能早日得到驗證并應(yīng)用于臨床治療，為骨肉瘤患者帶來福音。

4 BMP-2 基因甲基化與骨肉瘤

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP-2）是BMP 家族蛋白之一。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)20 個BMP 蛋白，有14 個在成骨細(xì)胞分化中具有很強(qiáng)的作用。其中，在所有的BMP 蛋白中，BMP-2 最活躍且具有較強(qiáng)的成骨能力，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族［32］。BMP-2 在早期的胚胎發(fā)生、骨骼發(fā)育以及成骨細(xì)胞成熟分化過程中起重要作用，它能夠通過誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)來刺激成骨細(xì)胞的增殖，從而誘導(dǎo)骨形成，例如：Run相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣素等［32］。Chen 等［33］研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)BMP-2 高表達(dá)，在給予干擾BMP-2 的表達(dá)后能夠明顯抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。也有研究證實，在骨肉瘤MG-63 細(xì)胞系中BMP-2 呈高表達(dá)［34］。BMP-2 能夠通過Wnt/b-catenin 信號通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的EMT，從而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和侵襲［32］。BMP-2基因啟動區(qū)域甲基化能夠抑制其表達(dá)，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生［34］。在骨性關(guān)節(jié)炎疾病中，BMP-2 甲基化能夠誘導(dǎo)Smads 與Sost 啟動子CpG 區(qū)親和力的改變，從而調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中Sost 的表達(dá)［35］。翁艷等［36］發(fā)現(xiàn)，與正常組織、良性病變組織相比，骨肉瘤組織中BMP-2基因低甲基化，故認(rèn)為BMP-2基因啟動子區(qū)甲基化程度與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，BMP-2基因甲基化的改變導(dǎo)致BMP-2 蛋白的表達(dá)失衡，進(jìn)而影響骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展。結(jié)合國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，由于BMP-2甲基化研究較少，對于骨肉瘤中BMP-2 蛋白的高表達(dá)是否是因為低甲基化所致的關(guān)系尚不明確，仍需深入研究。同時，對原發(fā)性骨腫瘤在使用BMP-2 相關(guān)治療或相關(guān)生物材料應(yīng)用時，應(yīng)注意BMP-2 能夠促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。

5 STAT3 基因甲基化與骨肉瘤

STAT3 是一種DNA 結(jié)合蛋白，是STAT 蛋白家族中重要的成員，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活中起著重要作用，進(jìn)而影響多種細(xì)胞類型的細(xì)胞的生長和凋亡［37］。STAT3 像STAT 家族其他蛋白一樣，在細(xì)胞暴露、細(xì)胞因子和生長因子中被激活。激活后，STAT3 能夠從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞核中，并與靶基因的啟動子結(jié)合到特定的序列上，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄［38］。STAT3 在多種癌癥疾病中起著重要作用，在腦部腫瘤疾病中起著致癌或抑癌作用，這取決于腫瘤的突變性質(zhì)，STAT3 的激活能夠促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展［39］。Xu 等［40］研究發(fā)現(xiàn)，在骨肉瘤樣本中，STAT3高度甲基化，其認(rèn)為STAT3基因甲基化可能影響STAT3 的表達(dá)，進(jìn)而參與了骨肉瘤的發(fā)展。STAT3是多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的樞紐，其通過基因甲基化與其他蛋白相互作用，在骨肉瘤中發(fā)揮作用。STAT3甲基化在骨肉瘤中的文獻(xiàn)較少，具有局限性，仍需進(jìn)一步的研究與驗證。

6 結(jié)語

目前，骨肉瘤的治療是世界難題之一，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，轉(zhuǎn)移及耐藥機(jī)制也未明確；其主要發(fā)病人群是青少年，并且大多數(shù)病人在初次診斷時已發(fā)生了肺部轉(zhuǎn)移，給個人、家庭、社會帶來巨大的健康問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近些年，骨肉瘤臨床治療研究進(jìn)展緩慢，在骨肉瘤病因?qū)W和生物學(xué)方面上的理解與臨床治療結(jié)果的改善仍存在較大的差距。甲基化是表觀遺傳改變方式之一。雖然國內(nèi)外研究癌癥的基因甲基化比較多，但對骨肉瘤相關(guān)基因甲基化的研究則甚少，而且大部分是在組織和細(xì)胞系的驗證及研究，并未與臨床相結(jié)合，體內(nèi)研究則很少涉及，臨床研究尚無報道，故存在一定的局限性和可靠性。骨肉瘤發(fā)病機(jī)制及基因組學(xué)非常復(fù)雜，并非一個基因或一條通路就可以解釋清楚，也并非基因甲基化可以完全闡述清楚，但是基因甲基化可以作為關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行研究，對早期診斷、基因治療、生物材料應(yīng)用、藥物研究等具有十分重要的意義。目前，雖然根據(jù)DNA 去甲基化治療的機(jī)制，去甲基化藥物decitabine（5-aza-DC）和azacitidine 已用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤，但是由于對基因甲基化在腫瘤發(fā)生中的具體作用機(jī)制沒有系統(tǒng)及深入的理解，導(dǎo)致在臨床上眾多癌癥中的應(yīng)用具有較大難度與風(fēng)險。骨肉瘤癌基因與抑癌基因是如何在骨肉瘤疾病中發(fā)生、發(fā)展過程中起作用，以及如何產(chǎn)生耐藥，都需要深入研究。因此，以基因甲基化為基點(diǎn)進(jìn)行深入研究，不僅能夠為闡明骨肉瘤疾病的發(fā)生提供理論依據(jù)，同時希望能夠在骨肉瘤臨床與科研中提供新的方向。