張冬冬，李 芮，劉曉明

（1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種常見的間質(zhì)性肺疾病，以成纖維細胞的過度增殖、細胞外基質(zhì)的生成降解失衡導致肺組織結(jié)構(gòu)破壞為主要病理特征，臨床上具有發(fā)病原因不明、致死致殘率高、慢性進行性加重、不可逆等特點。本病預后差，經(jīng)確診后平均存活年限為3～5年，5年存活率只有20%[1]。近年來，國內(nèi)外大量研究顯示，肺纖維化發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]，已成為全球關(guān)注的亟待解決的人類健康問題。

當前西醫(yī)針對PF的治療藥物主要有吡非尼酮和尼達尼布，另外常規(guī)治療手段為抗炎聯(lián)合免疫抑制劑，但僅可延緩肺纖維化的進展，緩解癥狀，并不能改善病灶[3]。因此醫(yī)學界大量學者將目光轉(zhuǎn)向中醫(yī)藥。有研究基于數(shù)據(jù)挖掘?qū)χ兴幹委煼卫w維化用藥規(guī)律分析后發(fā)現(xiàn)黃芪出現(xiàn)頻率最高[4]，針對黃芪治療肺纖維化的作用機制進行篩選，黃芪存在20種相關(guān)有效活性成分及457個相應作用靶點，且僅一種有效成分即可作用于多個具有不同功能的基因，發(fā)揮抗肺纖維化作用，這充分說明黃芪可多靶點-多途徑發(fā)揮不同功能抑制肺纖維化[5-6]。筆者分析總結(jié)了黃芪治療肺纖維化的作用機制，旨在為后續(xù)的研究提供具有針對性的研究思路。

1 抑制炎癥反應

炎癥細胞在肺纖維化發(fā)生、進展過程中起到了至關(guān)重要的作用。動物實驗表明，肺纖維化早期以炎癥細胞浸潤，肺泡炎癥為主，繼而出現(xiàn)成纖維細胞增生，晚期以纖維化改變?yōu)橹鱗7]。炎癥細胞主要有巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞等，其中以巨噬細胞為主，它可分泌多種促纖維化的細胞因子，如TNF-α、IL-1β等，還可通過介導信號途徑參與肺纖維化的發(fā)生[8-9]。

研究[10]發(fā)現(xiàn)黃芪多糖可在大鼠肺纖維化早期降低白細胞介素-4（IL-4）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，延緩肺纖維化進展。朱茜文等[11]研究證實黃芪多糖還可降低肺纖維化大鼠支氣管肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6濃度，減輕肺纖維化。細胞焦亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的需要憑借半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）進行的細胞死亡方式，是炎癥反應的重要途徑之一。王鵬飛等[12]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可降低特發(fā)性肺纖維化小鼠Caspase-1、IL-1β、IL-18的表達水平，減少細胞焦亡，抑制肺組織炎癥反應，降低炎細胞浸潤，減輕肺纖維化。研究發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能降低炎癥反應，抑制肺纖維化[13]。黃芪總皂苷、黃芪多糖、黃芪總黃酮均可抑制博來霉素誘導的肺纖維化模型中的炎癥反應，減少炎細胞聚集，其中黃芪總黃酮抗炎效果最為明顯，炎癥反應強度和纖維化程度呈正比，聯(lián)合用藥可提高療效[14]。

參與PF發(fā)展過程的巨噬細胞主要有肺泡巨噬細胞（AM）和肺間質(zhì)巨噬細胞（IM）兩類，兩者在肺纖維化不同進展時期向M1型和M2型轉(zhuǎn)化。M1型可在炎癥初期清除病原體，加快炎癥進展；M2型在晚期肺纖維化階段抑制炎癥反應，促進纖維化降解[15]。有學者研究發(fā)現(xiàn)，黃芪水提物可促進巨噬細胞向M1型轉(zhuǎn)化，抑制其向M2型轉(zhuǎn)化[16]。

2 協(xié)調(diào)氧化應激系統(tǒng)功能

氧化應激時氧化/抗氧化平衡失調(diào)，以氧化功能亢進為主，可導致細胞功能障礙和組織損傷。肺組織長期暴露于較高濃度的氧環(huán)境中，對氧化應激具有高敏感性，當體內(nèi)氧自由基大量累積或抗氧化能力不足時氧化應激便會被激活，此時肺組織將不可避免地發(fā)生損傷、修復及重構(gòu)[17]。臨床研究[18]表明，肺纖維化患者體內(nèi)存在異常的氧化活性。大量動物實驗證實，過強的氧化能力可加速肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，氧化應激的過度激活被認為是PF的重要發(fā)病機制之一。

劉建等[19]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可通過升高肺組織中GSH水平和降低MDA水平，調(diào)節(jié)氧化/抗氧化能力，達到治療肺纖維化的目的。王增霞[20]通過體外研究得到了相同的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能明顯提高人胚肺成纖維細胞（MRC-5）內(nèi)Nrf2轉(zhuǎn)錄激活，上調(diào)MRC-5細胞內(nèi)各抗氧化指標SOD、CAT、GSH，以及相關(guān)抗氧化蛋白HO-1、NQO1的表達水平，降低氧化損傷指標MDA水平，認為黃芪甲苷是通過干預Nrf2/ARE信號通路抑制氧化應激發(fā)揮抗纖維化作用。歐陽燕等[21]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可通過逆轉(zhuǎn)肺纖維化小鼠體內(nèi)異常升高的α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、血清丙二醛/總抗氧化能力比值（MDA/T-AOC）、NADPH氧化酶2（NOX2）、NOX4、超氧化物歧化酶3（SOD3）mRNA轉(zhuǎn)錄水平，抑制肺纖維化。欒智華等[22]研究發(fā)現(xiàn)黃芪糖蛋白也具有改善肺組織抗氧化的能力，主要表現(xiàn)在其能降低肺纖維化小鼠肺組織中TGF-β1、MDA表達水平，上調(diào)SOD表達水平。有研究[23]發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可在肺纖維化形成晚期調(diào)節(jié)NO代謝，增強肺組織抗氧化能力，維護肺纖維化大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的正常形態(tài)。

3 激活細胞自噬、抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化

自噬是指細胞自我吞噬、降解自身細胞質(zhì)蛋白或細胞器，以達到自身的代謝需求或完成某些細胞器的更新過程。大量研究表明，肺纖維化過程中p62及自噬體數(shù)量增加，LC3B、自噬相關(guān)重要基因（Beclin1、Atg14）表達減少[24]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是一個上皮細胞失去細胞黏附、基底極性，而獲得間充質(zhì)遷移、侵襲和產(chǎn)生ECM特性的生物學過程。目前這一過程的常見標志包括上皮細胞黏附分子E-鈣黏蛋白（E-caderin）丟失，間充質(zhì)標記蛋白波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等升高，這些標志在肺纖維化中均可被檢測到[25]。自噬和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中均占據(jù)緊要地位。近年來自噬與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的交互關(guān)系成為眾學者探究的焦點。徐存來等[26]研究發(fā)現(xiàn)增強肺纖維化小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的自噬水平可抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。這一實驗結(jié)論得到了有效證實，苗雙等[27]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)，IPF中的EMT過程抑制或激活水平與細胞自噬的誘導或抑制水平呈正比。因此激活細胞自噬，抑制EMT過程可作為肺纖維化的重要治療靶點。EMT可由多條信號通路調(diào)控，其中主要的包括TGF-β1/Smads信號通路、Notch信號通路、mTOR信號通路等[28]。

韓佳等[29]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪總皂苷可抑制TGF-β1信號通路下游Smad3蛋白合成，逆轉(zhuǎn)肺纖維化小鼠肺組織中EMT相關(guān)標志性蛋白（α-SMA、E-caderin）的表達。徐昌君等[30]研究了黃芪總黃酮抗肺纖維化的作用機制，發(fā)現(xiàn)黃芪總黃酮可通過抑制TGF-β1/Smads信號通路上游miRNA-21基因的表達激活，調(diào)節(jié)下游Smad7、Smad3、α-SMA的表達水平，阻礙TGF-β1/Smads信號通路，從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。黃芪多糖也具有相同的作用機制[11]。研究證實黃芪注射液可通過下調(diào)TGF-β1，抑制肺組織上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[31]。

ZHOU Y等[32]采用黃芪注射液腹腔注射干預BLM誘導的肺纖維化大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠肺組織中α-SMA、TGF-β1、Jagged-1、Notch1表達水平均降低，表明黃芪注射液能通過抑制Notch信號通路Notch受體及其配體Jagged-1表達，阻礙上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，減輕肺纖維化。

王鵬飛等[12]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以提高肺纖維化小鼠肺組織LC3Ⅱ蛋白表達，降低p62蛋白沉淀，激活自噬抑制肺纖維化。黃霂晗等[33]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷抑制肺纖維化作用與降低肺組織中α-SMA及膠原蛋白表達，減少成纖維細胞增殖有關(guān)。王鵬飛等[12]的研究和黃霂晗等[33]的研究均針對單個細胞因子，未對相關(guān)信號通路展開研究，實驗結(jié)果較單一。徐昌君等[34]對此進行深入研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷作用于mTOR相關(guān)信號通路，除了可干預LC3Ⅱ、p62蛋白表達外，還能下調(diào)TGF-β1表達，提高Beclin-1表達，抑制p-PI3K/PI3K，p-Akt/Akt，p-m TOR/m TOR表達，降低α-SMA表達水平，升高E-caderin表達水平。因此，黃芪甲苷可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路增強肺組織細胞自噬活性，從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，延緩肺纖維化進程。杜全宇等[35]對黃芪多糖治療肺纖維化機制進行實驗研究后發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖也可作用于mTOR信號通路，降低肺組織中mTOR蛋白及其所在信號通路下游效應蛋白p-S6、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白α-SMA表達，抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，減少肌成纖維細胞的增殖分化，減輕肺纖維化程度。欒智華等[36]研究證實黃芪糖蛋白可抑制肺組織中α-SMA蛋白生成干預肺纖維化，實驗未對α-SMA蛋白所在信號轉(zhuǎn)導通路進行深入研究。目前關(guān)于黃芪糖蛋白治療肺纖維化作用機制的研究較少，待進一步跟進。

除此3種誘導EMT常見信號通路外，于競澤[37]通過動物實驗及體外實驗研究發(fā)現(xiàn)，采用黃芪總皂苷對肺纖維化模型進行干預后，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)蛋白的活化水平明顯降低，各細胞中自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量明顯升高，自噬相關(guān)蛋白（LC3B-Ⅱ）表達及自噬相關(guān)基因（Beclin-1、ATG5、ATG7）mRNA轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，細胞外基質(zhì)膠原（Col-Ⅰ、Col-Ⅲ）沉積明顯減少，同時利用生物抑制劑進行Ras/Raf/MEK/ERK信號通路阻斷實驗后證實，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路活化水平與肺成纖維細胞自噬呈負相關(guān)。因此黃芪總皂苷可抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，激活肺成纖維細胞自噬，進而減少細胞外基質(zhì)沉積，延緩肺纖維化。

4 維持基質(zhì)金屬蛋白酶系平衡

細胞外基質(zhì)在肺間質(zhì)的大量堆積是肺纖維化的主要病理特征之一。大量研究表明，ECM的過量沉積與基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的比例失調(diào)密切相關(guān)。MMPs是一組主要降解ECM的鋅離子依賴酶群，在正常狀態(tài)下，活性水平較低，當肺組織發(fā)生纖維化或炎癥時，MMPs活化水平明顯提升，其中包括有PF抑制作用的MMP-1、MMP-19等，旨在降解ECM，減少膠原蛋白的合成，但也有對PF起促進作用的MMP-7、MMP-9等，可激活上皮-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，誘導巨噬細胞極化和纖維細胞遷移，這些抗纖維化和促纖維化介質(zhì)之間的平衡遭到破壞后，導致異常修復過程[38-40]，出現(xiàn)肺纖維化。

基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的特異性內(nèi)源抑制因子，它以1∶1的比例與MMPs的活性位點相結(jié)合降低其活性。有研究指出，MMP-9/TIMP-1＞1時基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)具有降解ECM效應，阻止纖維化的發(fā)生，而當比值＜1時則處于纖維化進展期[41]，正常肺組織中兩者處于動態(tài)平衡狀態(tài)。張千一等[42]研究發(fā)現(xiàn)肺纖維化大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1均升高，且MMP-9/TIMP-1比例發(fā)生失衡，用藥干預后兩者比例得到改善，肺纖維化進程亦得以延緩。因此調(diào)控MMPs、TIMPs的表達，維持MMPs/TIMPs的穩(wěn)態(tài)平衡可抑制ECM沉積，起到抗肺纖維化的作用。

彭清等[43]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液腹腔注射干預肺纖維化大鼠后，大鼠肺組織中MMP-2 mRNA、TIMP-1 mRNA表達水平均降低，MMP-2/TIMP-1比值趨于平衡，肺纖維化進程被抑制。黃芪注射液可明顯下調(diào)肺纖維化患者血清中MMP-9，顯著提高療效[44]。但該實驗存在明顯缺陷，其未觀察TIMP-1指標變化，未探尋黃芪注射液通過調(diào)控MMP-9/TIMP-1之間的比例平衡干預肺纖維化的作用機制?？麓哄\等[45]實驗證實黃芪提取物可抑制博來霉素誘導的肺纖維化大鼠肺組織中的MMP-9、TIMP-1，調(diào)控兩者之間比例，延緩肺纖維化發(fā)展。

5 抑制肺部血管新生

肺臟血管異常增生是PF的重要發(fā)病機制之一。研究顯示，肺纖維化中許多血管新生相關(guān)細胞因子異常升高，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（BFGF）等[46-47]，肺部血管增生明顯，微血管密度升高。欒智華等[48]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可降低肺纖維化小鼠血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2）mRNA表達，抑制肺部血管生成，減輕肺纖維化程度。還有研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能明顯抑制肺纖維化大鼠BFGF表達，抑制微血管增生從而降低MVD，達到抗肺纖維化作用，其作用效果具有劑量依賴性[49]。另外，黃芪水提物也可降低VEGF及其基因的表達，改善肺纖維化程度[50]。

6 小 結(jié)

肺纖維化臨床致死率不亞于腫瘤，且發(fā)病率呈逐年升高趨勢，但目前尚無理想的治療藥物，發(fā)病機制尚不完全清楚，錯綜復雜[51]。因此，尋找更加有效的治療靶點及藥物的研發(fā)是當下的首要方向。目前針對黃芪治療PF發(fā)病機制主要包括炎癥反應、氧化應激、細胞自噬被抑制、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、基質(zhì)金屬蛋白酶系失衡、新生血管過度等因素。各因素之間存在關(guān)聯(lián)制約關(guān)系，激活自噬可降低氧化應激水平從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，維持MMPs/TIMPs動態(tài)平衡，減輕肺纖維化[27，52-53]；另外，多種效應中涉及多條相同信號通路、細胞因子，但多數(shù)關(guān)于黃芪治療肺纖維化的實驗研究只針對單一細胞因子或信號通路，缺乏多種作用機制網(wǎng)絡(luò)串聯(lián)關(guān)系的系統(tǒng)研究。有些單一信號通路研究尚不完整，缺乏精確性，如黃芪甲苷可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路增強肺組織細胞自噬活性，從而抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，延緩肺纖維化進程；黃芪甲苷還可降低肺纖維化小鼠VEGF、VEGFR-2、BFGF表達，抑制肺部血管生成，減輕肺纖維化程度。有研究證實PI3K/Akt信號通路是血管新生的調(diào)控中心[54]，同時還能上調(diào)MMPs表達水平，間接促進EMT[55]。但黃芪甲苷抑制血管新生、抑制EMT是否也與此信號通路有關(guān)尚無實驗證實。

研究界對黃芪治療肺纖維化機制做了大量研究，取得了可觀的實驗成果，且已有黃芪類藥物制劑應用于臨床治療肺纖維化，但其具體作用機制及治療靶標仍有待進一步精確完善，為臨床用藥及新型藥物的研發(fā)提供新思路。