周 健，張子安，趙海波，于騰波*，張英澤

（1.青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院骨科；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，山東青島 266003）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變、軟骨下骨重構(gòu)以及滑膜炎癥為主要特征的慢性退行性骨關(guān)節(jié)疾病，可以導(dǎo)致軟骨細(xì)胞表型和軟骨穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變，好發(fā)于髖、膝關(guān)節(jié)，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)僵硬，嚴(yán)重者可致關(guān)節(jié)畸形，導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，嚴(yán)重降低了患者的生活質(zhì)量［1～2］。探索OA的分子發(fā)病機(jī)制，延緩OA進(jìn)程，尋找新的診斷及預(yù)防手段，一直是骨科領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)問(wèn)題。傳統(tǒng)的RNA測(cè)序技術(shù)（bulk RNA-seq）是將組織中的細(xì)胞RNA混合后進(jìn)行分析，無(wú)法獲取單個(gè)細(xì)胞的信息。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（single cell RNA sequencing,scRNA-seq）可以對(duì)組織中的細(xì)胞進(jìn)行獨(dú)立分析，在細(xì)胞圖譜構(gòu)建、細(xì)胞亞群細(xì)化及稀有細(xì)胞類型鑒定、疾病標(biāo)志性致病基因及干細(xì)胞發(fā)育分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已經(jīng)在腫瘤、心血管病、神經(jīng)科學(xué)等諸多學(xué)科廣泛應(yīng)用［3～6］，但在骨關(guān)節(jié)領(lǐng)域，包括OA、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheu?matoid arthritis,RA）、創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎以及滑膜炎等疾病的研究還處于起步階段。隨著研究的不斷深入，OA的分子發(fā)病機(jī)制與發(fā)病過(guò)程、細(xì)胞類型與疾病之間的關(guān)系、病變的軟骨細(xì)胞如何再生等問(wèn)題會(huì)有新的見(jiàn)解。本文對(duì)scRNA-seq技術(shù)及在OA方面的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 單細(xì)胞轉(zhuǎn)組測(cè)序技術(shù)

scRNA-seq技術(shù)是從單個(gè)細(xì)胞水平獲得全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜，可以揭示單細(xì)胞的基因表達(dá)情況、細(xì)胞間基因的交互調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，尋找細(xì)胞間異質(zhì)性。真核細(xì)胞包含許多不同的RNA，目前以檢測(cè)mRNA為主，長(zhǎng)鏈非編碼 RNA（lncRNA）和環(huán)狀 RNA（circRNA）等也可被檢測(cè)［7，8］。scRNA-seq分析的主要步驟包括單細(xì)胞分離→全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增→構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)→高通量測(cè)序→數(shù)據(jù)分析。

1.1 單細(xì)胞分離技術(shù)

scRNA-seq的第一步是將目的細(xì)胞從樣本中高質(zhì)量的分離出來(lái)，常用的方法有：連續(xù)稀釋法（serial dilution）、顯微操作技術(shù)（micromanipulation）、激光捕獲顯微切割法（laser capture microdissec-tion,LCM）、熒光激活細(xì)胞分選法（fluorescence activated cell sorting,FACS）和微流控法（microfluidics）。FACS法可以根據(jù)細(xì)胞的特征進(jìn)行快速分離，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、通量高等優(yōu)點(diǎn)，但需要細(xì)胞初始樣本量較大。目前常用的是微流控技術(shù)，有液滴式微流控和芯片式微流控兩種方式，將細(xì)胞分離至納升級(jí)的微容器中進(jìn)行分離、捕獲單個(gè)細(xì)胞，具有精準(zhǔn)控制、所需求樣本及試劑少、高分辨率和高靈敏度等特點(diǎn)，是目前單細(xì)胞分離最好的方法［9］。

1.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)

單細(xì)胞測(cè)序方法是基于DNA進(jìn)行的，也就是需要將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，其中關(guān)鍵點(diǎn)為：首先，盡量在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中減少mRNA的損失；其次，擴(kuò)增后要提供足夠多的DNA進(jìn)行測(cè)序［10］。自單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)以來(lái)，相關(guān)新技術(shù)手段不斷被開(kāi)發(fā)出來(lái)，目前常用的擴(kuò)增方法有模板轉(zhuǎn)換法 SMART技術(shù) （Smart-seq/Smart-seq2、STRT-seq）、體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增技術(shù)（CEL-seq/CEL-seq2、Quartz-seq）、微流體技術(shù)Drop-seq和inDrop技術(shù)。

1.2.1 SMART擴(kuò)增技術(shù)

Smart-seq技術(shù)可以得到mRNA全長(zhǎng)，能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體的分析。Smart-Seq2由Smart-seq基礎(chǔ)上改進(jìn)而來(lái)，可以增加單細(xì)胞的cDNA文庫(kù)產(chǎn)量和平均長(zhǎng)度，實(shí)現(xiàn)更高靈敏度，降低擴(kuò)增偏倚［11］。

1.2.2 CEL-seq和CEL-seq2技術(shù)

是利用體外線性擴(kuò)增單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的方法。利用含有oligo-dT序列、獨(dú)特條形碼、測(cè)序接頭和引物將單細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄成合成cDNA一鏈、二鏈，通過(guò)體外線性擴(kuò)增獲得足夠的cDNA構(gòu)建文庫(kù)［12］。CEL-seq2能減少擴(kuò)增偏倚，具有更高的可重復(fù)性和靈敏度。

1.2.3 Drop-seq和inDrop微流控技術(shù)

Drop-seq和inDrop技術(shù)由哈佛大學(xué)開(kāi)發(fā)，利用微流體技術(shù)結(jié)合scRNA-seq，使微珠直接捕獲mRNA，在一個(gè)液滴中完成全部反應(yīng)，產(chǎn)物濃度更高，且成本更低［13］。

1.3 單細(xì)胞測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

文庫(kù)構(gòu)建是轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增之后的一個(gè)關(guān)鍵步驟，首要解決的問(wèn)題是用mRNA準(zhǔn)確建庫(kù)，避免擴(kuò)增偏倚，提高靈敏度和可重復(fù)性，并獲得細(xì)胞追溯來(lái)源。文庫(kù)構(gòu)建的核心技術(shù)是捕獲目標(biāo)樣本內(nèi)的總RNA，關(guān)鍵步驟是全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，將RNA完全逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行線性擴(kuò)增，獲得足量cDNA用于構(gòu)建文庫(kù)。擴(kuò)增完成后檢查擴(kuò)增片段大小及擴(kuò)增產(chǎn)量是否合格，對(duì)文庫(kù)進(jìn)行濃度和峰型檢測(cè)，質(zhì)檢合格后做成Illumina測(cè)序文庫(kù)。不論選擇哪種方法，只有高質(zhì)量的文庫(kù)才能得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

1.4 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及平臺(tái)

高通量測(cè)序技術(shù)可以一次對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子同時(shí)進(jìn)行測(cè)序，主要為全長(zhǎng)（full-length）測(cè)序與基于標(biāo)簽（tag-based）測(cè)序［14］。目前常用的單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)有10xGenomics Chromium單細(xì)胞平臺(tái)、BD Rhapsody?單細(xì)胞分析系統(tǒng)、Illumina?Bio-Rad?和ICELL8單細(xì)胞分析平臺(tái)、C1?單細(xì)胞全自動(dòng)制備系統(tǒng)。10xGenomics Chromium單細(xì)胞平臺(tái)利用與Dropseq相似的技術(shù)原理進(jìn)行測(cè)序，能夠高效的進(jìn)行單細(xì)胞標(biāo)記、測(cè)序及分析，在短時(shí)間內(nèi)每個(gè)樣本可以測(cè)得幾萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息，成本低，應(yīng)用廣泛。BD Rhapsody單細(xì)胞分析系統(tǒng)基于微孔技術(shù)，使一個(gè)微孔中通過(guò)一個(gè)細(xì)胞，提高了捕獲單細(xì)胞的效率，使用分子標(biāo)簽技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)靶向測(cè)序，具有轉(zhuǎn)錄更加準(zhǔn)確、檢出率更高等優(yōu)勢(shì)。

1.5 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)處理及分析

高通量測(cè)序后在數(shù)據(jù)分析前必須進(jìn)行質(zhì)量控制，剔除可能存在偏差的測(cè)序數(shù)據(jù)，提高數(shù)據(jù)分析的精度和效率。scRNA-seq數(shù)據(jù)分析流程包括數(shù)據(jù)預(yù)處理、細(xì)胞和基因水平的后續(xù)分析，常用的預(yù)處理策略主要有核酸文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化、質(zhì)量控制、表達(dá)矩陣的歸一化、數(shù)據(jù)校正、降維等［15］。后續(xù)數(shù)據(jù)分析主要是利用生物信息學(xué)手段將所得到數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾和標(biāo)準(zhǔn)化后的可視化處理，基于過(guò)濾后獲得高質(zhì)量的細(xì)胞基因表達(dá)譜，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行差異基因分析、聚類分析、細(xì)胞軌跡推測(cè)、尋找marker基因、細(xì)胞相互作用、功能富集等。

2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在OA領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值

2.1 在骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的應(yīng)用

軟骨組織中，軟骨細(xì)胞為其中唯一的細(xì)胞成分，在細(xì)胞外基質(zhì)代謝和維持軟骨組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，由間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)［16］，分為透明軟骨、纖維軟骨及彈性軟骨。研究表明關(guān)節(jié)軟骨中的軟骨細(xì)胞可以分為增殖性軟骨細(xì)胞（ProCs）、衰老細(xì)胞（SnCs）、前肥大性軟骨細(xì)胞（preHTCs）、肥大性軟骨細(xì)胞（HTCs）和軟骨祖細(xì)胞（CPCs）［17-20］，不同的軟骨細(xì)胞亞型具有不同的功能，并且軟骨細(xì)胞的表型改變能夠?qū)е鹿顷P(guān)節(jié)炎軟骨退變的發(fā)生［21］，衰老細(xì)胞具有細(xì)胞周期阻滯和衰老相關(guān)分泌表型特征，局部清除后可以延緩創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［18］。軟骨祖細(xì)胞主要作用是維持細(xì)胞的自我更新，并可以多向分化，表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面的標(biāo)記，有助于OA軟骨細(xì)胞的修復(fù)［22］。Ji等［23］研究發(fā)現(xiàn)了軟骨細(xì)胞的3個(gè)新表型細(xì)胞群，這幾種細(xì)胞均是早期OA軟骨細(xì)胞，其中，穩(wěn)態(tài)軟骨細(xì)胞（HomCs）被發(fā)現(xiàn)與生物節(jié)律有關(guān)。前肥大性軟骨細(xì)胞及肥大性軟骨細(xì)胞主要為晚期OA軟骨細(xì)胞，而穩(wěn)態(tài)軟骨細(xì)胞分布于整個(gè)OA過(guò)程。效應(yīng)軟骨細(xì)胞、調(diào)節(jié)性軟骨細(xì)胞和穩(wěn)態(tài)軟骨細(xì)胞可能保護(hù)軟骨不發(fā)生OA，而增殖性軟骨細(xì)胞、前肥大性軟骨細(xì)胞可能促進(jìn)OA進(jìn)展。一項(xiàng)對(duì)3例健康人半月板的研究發(fā)現(xiàn)，半月板軟骨細(xì)胞分為7個(gè)亞型，其中包括2個(gè)新亞型。7個(gè)軟骨細(xì)胞群分別為內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、軟骨祖細(xì)胞（CPC）、調(diào)節(jié)性軟骨細(xì)胞（RegCs）、纖維軟骨細(xì)胞（FC）、增殖前軟骨細(xì)胞（PreHTC），纖維軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞（FCP）和增殖纖維軟骨細(xì)胞（ProFC）。擬時(shí)序分析確定了內(nèi)皮細(xì)胞及纖維軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞處于起始處，并驗(yàn)證確定了兩者具有祖細(xì)胞特性［24］。半月板中的祖細(xì)胞被認(rèn)為具有促進(jìn)半月板損傷修復(fù)的功能［25］。

2.2 在骨關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞中的應(yīng)用

滑膜細(xì)胞有A、B兩種類型，巨噬細(xì)胞樣A型細(xì)胞和成纖維樣B型滑膜細(xì)胞，具有分泌滑液減少關(guān)節(jié)軟骨的摩擦系數(shù)和吸收作用及吞噬功能。研究表明滑膜成纖維細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞是RA等炎癥性關(guān)節(jié)疾病以及導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)破壞的因素［26～28］。一項(xiàng)關(guān)于滑膜成纖維細(xì)胞介導(dǎo)炎癥及關(guān)節(jié)損傷的研究表明，成纖維細(xì)胞活化蛋白、成纖維細(xì)胞的兩個(gè)亞型（破壞性成纖維細(xì)胞和免疫效應(yīng)成纖維細(xì)胞）具有不同的功能，前者可以選擇性地介導(dǎo)骨與軟骨損傷，對(duì)炎癥幾乎沒(méi)有影響，而后者導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎加重，對(duì)骨和軟骨的影響最小［29］。研究發(fā)現(xiàn)滑膜成纖維細(xì)胞分為3種主要細(xì)胞亞群，并且在RA患者中的滑膜成纖維細(xì)胞亞群較OA患者增加了3倍，兩類患者的滑膜成纖維細(xì)胞具有相似的轉(zhuǎn)變過(guò)程，同時(shí)也具有異質(zhì)性［30-32］。Zhang等［33］研究發(fā)現(xiàn)了4種成纖維細(xì)胞亞群、4種單核細(xì)胞亞群、4種B細(xì)胞亞型的特征。OA患者多伴有滑膜組織炎癥，scRNA-seq可以在單細(xì)胞水平上分析OA患者不同時(shí)期滑膜組織細(xì)胞的異質(zhì)性，發(fā)現(xiàn)新的滑膜細(xì)胞亞群，為OA的分子病理診斷及靶向治療提供新的標(biāo)準(zhǔn)。

3 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的優(yōu)勢(shì)與不足

與傳統(tǒng)的bulk測(cè)序方法相比，scRNA-seq能夠檢出單個(gè)細(xì)胞間的異質(zhì)性信息，準(zhǔn)確記錄細(xì)胞空間位置及譜系分化軌跡，發(fā)現(xiàn)微量基因表達(dá)或罕見(jiàn)非編碼RNA；從單細(xì)胞水平上了解OA的分子發(fā)病機(jī)制，為靶向治療OA提供了依據(jù)。但scRNA-seq操作過(guò)程相對(duì)繁瑣，對(duì)細(xì)胞懸液活性要求高，技術(shù)噪音高，且目前的檢測(cè)主要集中在mRNA，對(duì)于非編碼RNA檢測(cè)仍有困難；在骨科領(lǐng)域存在著許多挑戰(zhàn)，如軟骨細(xì)胞單細(xì)胞制備、儲(chǔ)存、擴(kuò)增等較一般細(xì)胞困難，目前尚缺乏實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)分析的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)流程。

4 展 望

隨著scRNA-seq技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量技術(shù)及轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)的日臻完善，針對(duì)scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析工具和軟件也更強(qiáng)大，在OA領(lǐng)域的研究會(huì)更加深入。結(jié)合單細(xì)胞多組學(xué)及空間轉(zhuǎn)錄組的信息，可以全面分析OA的分子發(fā)病機(jī)制及病理分期，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)，有助于OA的早期診斷、早期干預(yù)治療和精準(zhǔn)靶向治療，減少晚期骨關(guān)節(jié)炎給患者帶來(lái)的痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。