趙重燕，暴會(huì)會(huì)，杜康華，楊正安，楊 飛

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林園藝學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，云南生物多樣性保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

雄性不育優(yōu)良品系的創(chuàng)新一直是科學(xué)家們的研究重點(diǎn)[1]。擬南芥花藥發(fā)育過程中約有3 500 個(gè)花藥特異轉(zhuǎn)錄本[2]，反映了花藥發(fā)育過程基因的多樣性及復(fù)雜的花藥發(fā)育調(diào)節(jié)過程，花藥發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究在雄性不育過程中十分重要，因此對(duì)花藥發(fā)育調(diào)控基因的研究具有重要的意義。

在植物花藥發(fā)育過程中，絨氈層特異表達(dá)基因(aborted microspores，AMS)是絨氈層和小孢子發(fā)育所必需，是植物花粉壁合成的關(guān)鍵因子。AMS包含1 個(gè)基本的螺旋—環(huán)—螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)域，屬于bHLH 轉(zhuǎn)錄因子中的MYC 類亞家族基因[3]。MYC 蛋白已被認(rèn)為是控制細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它可以激活或抑制特定的靶基因表達(dá)[4]。AMS基因也具有相同的調(diào)控作用，該基因突變會(huì)導(dǎo)致過早的絨氈層退化和花粉敗育。AMS基因在不同植物的小孢子發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中存在高度相似性，目前已在擬南芥、水稻、甜瓜、辣椒、葡萄、大豆和洋蔥等植物上進(jìn)行過研究。本文綜述不同植物中AMS基因功能研究進(jìn)展，分析花藥發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控途徑。

1 花藥和花粉發(fā)育

在開花植物中，花藥發(fā)育是調(diào)節(jié)花藥內(nèi)特定細(xì)胞分化的復(fù)雜事件[5]，涉及多個(gè)雄蕊特異性轉(zhuǎn)錄本，是植物育種的關(guān)鍵步驟，也是成功育種和形成種子所必需的環(huán)節(jié)?；ǚ鄣男纬扇Q于花藥中2種細(xì)胞類型的分化和相互作用[6]：生殖細(xì)胞(小孢子細(xì)胞)和形成絨氈層的體細(xì)胞。小孢子被由內(nèi)到外的絨氈層、中間層、內(nèi)皮層和表皮層4 個(gè)體細(xì)胞層所包圍，從而支持小孢子發(fā)育為成熟的花粉粒[7]?；ǚ郯l(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及許多事件，尤其是絨氈層發(fā)育和花粉外壁形成。絨氈層作為分泌細(xì)胞層，不僅與發(fā)育中的配子體直接接觸，且提供酶促進(jìn)四分體釋放小孢子，提供蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖等養(yǎng)分促進(jìn)花粉壁的形成，從而促進(jìn)花粉的發(fā)育[8]。在花粉發(fā)育的后期會(huì)經(jīng)歷絨氈層細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡(program cell death，PCD)事件[9]，依次消除細(xì)胞結(jié)構(gòu)。絨氈層細(xì)胞的分化和隨后的分解與減數(shù)分裂后的花藥發(fā)育程序非常吻合，絨氈層的過早或延遲降解與雄性不育有關(guān)[10]?；ǚ弁獗谥饕涉叻鬯匦纬?，孢粉素是一種脂族聚合物，由長鏈脂肪酸、苯基丙烷和氧化的芳香環(huán)衍生的一系列聚合物組成[11]。

花藥和花粉的發(fā)育已經(jīng)在擬南芥、水稻、黃瓜和辣椒等植物中得到廣泛的研究[12-13]，從雙子葉模式植物擬南芥到單子葉模式植物水稻2 個(gè)物種的花粉發(fā)育都涉及相似的關(guān)鍵階段。不同物種中直系同源基因的雄性不育突變體的特征進(jìn)一步證明這些階段背后調(diào)控途徑的保守性。這對(duì)了解和研究其他植物中花藥發(fā)育調(diào)控途徑具有重大的意義。

2 AMS 基因與植物雄性不育

AMS屬于bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子，是植物花粉壁合成的關(guān)鍵因子，AMS突變植株會(huì)導(dǎo)致花粉形成異常，進(jìn)而造成雄性不育。植物雄性育性的控制對(duì)于作物育種、雜種的產(chǎn)生以及花粉釋放的控制至關(guān)重要。目前，已在許多植物中發(fā)現(xiàn)雄性不育株，并經(jīng)過人工選育獲得不育系廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)[14-15]。但是對(duì)于花粉不育類型和雄蕊退化型性狀的保持比較困難，且不育特性受環(huán)境影響較大，不易獲得100%不育度，致使花粉不育和雄蕊退化型極少在生產(chǎn)上應(yīng)用[16]。因此加強(qiáng)對(duì)雄性不育調(diào)控機(jī)制的研究很有必要，以此可獲得有應(yīng)用價(jià)值的不育材料。對(duì)不同物種AMS突變體的形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)等的研究，可為闡明復(fù)雜的花藥發(fā)育調(diào)控途徑奠定基礎(chǔ)。

2.1 AMS 基因調(diào)節(jié)擬南芥雄性不育

AMS基因參與植物雄性不育調(diào)控的研究首先在擬南芥(Arabidopsis)中被報(bào)道[3]，研究者分離獲得敗育的小孢子(ams)突變體，對(duì)AMS突變植株進(jìn)行表型鑒定及序列分析，發(fā)現(xiàn)純合突變植物完全沒有成熟的花粉，花粉敗育發(fā)生在小孢子從四分體釋放后不久、有絲分裂I 之前。AMS在擬南芥花藥的絨氈層細(xì)胞發(fā)育和減數(shù)分裂后轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。XU 等[17]通過微陣列分析擬南芥AMS突變植株的花藥，結(jié)果表明：ams突變體中，有549 個(gè)與絨氈層和花粉壁形成有關(guān)的花藥基因的表達(dá)發(fā)生變化，還鑒定出涉及脂質(zhì)、寡肽和離子運(yùn)輸、脂肪酸合成和代謝以及黃酮醇積累等有關(guān)的13 個(gè)基因是AMS的直接靶標(biāo)。MA 等[18]同樣對(duì)AMS突變植株早期的花藥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)有1 368 個(gè)基因在ams中差異表達(dá)，影響代謝、運(yùn)輸、泛素化和脅迫反應(yīng)。對(duì)轉(zhuǎn)錄組的仔細(xì)分析并將其與遺傳和系統(tǒng)發(fā)育信息相結(jié)合，揭示了在花藥早期發(fā)育過程中建立的精細(xì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并擴(kuò)大了對(duì)與花藥發(fā)育相關(guān)的基因?qū)哟谓Y(jié)構(gòu)的理解。AMS基因在花粉壁形成過程中有重要的調(diào)控作用，XU 等[19]用全基因組共表達(dá)分析揭示了在擬南芥ams突變體中有70 個(gè)花藥特異表達(dá)候選基因表達(dá)量降低，這其中有23 個(gè)基因是AMS 調(diào)控的靶基因。這些基因與脂肪酸延伸、酚類化合物的形成及孢粉素前體合成有關(guān)，證實(shí)豐富的花粉外殼蛋白細(xì)胞外脂肪酶(EXL5 和EXL6)以 及CYP98A8 和CYP98A9 酶是合成酚類物質(zhì)前體所需的。分析結(jié)果證明了AMS在協(xié)調(diào)孢粉蛋白生物合成和花粉壁形成中的核心作用。基因和蛋白之間的相互作用調(diào)節(jié)形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，ZHANG 等[20]報(bào)道了1 個(gè)功能不正常的擬南芥DYT1雄性不育突變體，該突變體表現(xiàn)出異常的花藥形態(tài)，絨氈層細(xì)胞高度液泡化，且缺乏正常的細(xì)胞質(zhì)，突變體無法完成減數(shù)分裂胞質(zhì)分裂并最終崩潰，不能形成花粉而導(dǎo)致雄性不育。DYT1 蛋白與擬南芥AMS 蛋白具有很高的相似性，可調(diào)控參與花藥絨氈層細(xì)胞的分化和發(fā)育過程，DYT1促進(jìn)正確的絨氈層以發(fā)揮其正常功能，之后AMS和MS1進(jìn)一步調(diào)節(jié)絨氈層細(xì)胞功能以支持正常的小孢子發(fā)育，提出DYT1位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中AMS和MS1的上游。GU 等[21]利用染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)分析明確了AMS是DYT1的下游調(diào)控基因。XIONG等[22]通過酵母雙雜交和電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSAs)證明MS 188 與AMS 形成復(fù)合物，CYP703A2(孢粉蛋白合成途徑中充當(dāng)脂肪酸羥化單加氧酶)的表達(dá)可以通過ams突變體中MS188水平的升高部分恢復(fù)，表明MS188與AMS協(xié)同激活CYP 703A2在植物絨氈層生物合成中的作用。

絨氈層發(fā)育的遺傳學(xué)研究證明存在DYT1-TDF1-AMS-MS188的分子調(diào)控通路[23]。DYT1、TDF1和AMS在絨氈層的早期發(fā)育中起作用，而MS188和MS1在絨氈層的后期發(fā)育中起作用。這些轉(zhuǎn)錄因子除激活其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)外，還調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過程，AMS可能調(diào)節(jié)參與花粉壁形成的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白和E3 泛素連接酶，從而降解先前過程中產(chǎn)生的蛋白。FERGUSON 等[24]研究表明：AMS在早期和晚期花粉發(fā)育過程中均表現(xiàn)出復(fù)雜的調(diào)控表達(dá)并具有迄今未表征的雙重作用；進(jìn)一步研究絨氈層功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，表明反饋回路和調(diào)節(jié)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)對(duì)于控制花藥絨氈層中瞬時(shí)基因表達(dá)以產(chǎn)生可育的花粉至關(guān)重要。

2.2 AMS 同源基因TDR 調(diào)節(jié)水稻雄性不育

水稻(Oryza sativa)是人類的糧食作物，可養(yǎng)活近一半的全球人口，而且還是促進(jìn)植物科學(xué)研究的理想單子葉植物模型。目前水稻中已經(jīng)報(bào)道參與小孢子發(fā)育的bHLH 轉(zhuǎn)錄因子包括UDT1(OsbHLH164)、EAT1/DTD (OsbHLH141)、bHLH142/TIP2 (OsbHLH142)和TDR1 (OsbHLH5)等，他們大部分在絨氈層細(xì)胞程序性死亡和花粉形成過程中起關(guān)鍵作用，其突變植株會(huì)導(dǎo)致花粉形成異常，進(jìn)而引起雄性不育[25]。這些轉(zhuǎn)錄因子的功能異常所引起的細(xì)胞雄性不育在細(xì)胞水平上具有一定的相似性。

TDR與擬南芥中的AMS是直系同源基因，LI 等[26]首次報(bào)道了水稻雄性不育突變體tdr的分離和表征，發(fā)現(xiàn)該TDR基因優(yōu)先在絨氈層中表達(dá)，并編碼1 個(gè)假定的基本螺旋—環(huán)—螺旋蛋白。通過染色質(zhì)免疫沉淀分析和電泳遷移率變動(dòng)分析，得出編碼Cys 蛋白酶和蛋白酶抑制劑的OsCP1和Osc6可能是TDR的直接靶標(biāo)，后續(xù)研究表明OsC6 蛋白是TDR的直接靶標(biāo)[27]。水稻tdr突變體花粉壁的形成發(fā)生明顯的改變[28]，花藥中的脂肪酸、伯醇、烷烴和鏈烯烴等含量異常增加。TDR除具有促進(jìn)絨氈層PCD的功能外，還可能在水稻花粉發(fā)育過程中的幾個(gè)基本生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。GAMYB和UDT1在早期階段可并行調(diào)節(jié)花藥發(fā)育，并可能積極激活TDR的表達(dá)[29]。TDR和EAT1相互作用，直接調(diào)節(jié)編碼天冬氨酸蛋白酶的OsAP25和OsAP37的表達(dá)[30]，對(duì)水稻花藥發(fā)育過程的細(xì)胞程序性死亡調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有利的研究工具。F-box 蛋白Os-ADF 作為TDR的直接靶標(biāo)之一，在水稻絨氈層細(xì)胞的發(fā)育和花粉形成中起著至關(guān)重要的作用[31]。水稻基本螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)蛋白TDR 相互作用蛋白2 (TIP2)在早期花藥發(fā)育過程中，作為分生組織過渡和分化的關(guān)鍵開關(guān)，是細(xì)胞程序性死亡的主要調(diào)控因子[32-33]。TIP2是與TDR相互作用的另一種bHLH，作用于UDT1的下游，但在TDR和EAT1的上游，而TIP2可以與TDR形成二聚體以通過與其啟動(dòng)子結(jié)合來進(jìn)一步激活EAT1轉(zhuǎn)錄。最新的研究[34]結(jié)果表明：TIP3在調(diào)控花粉外壁形成中發(fā)揮著重要的作用，TIP3或TIP3與TDR的相互作用可能直接或間接激活特定的下游基因來調(diào)節(jié)水稻的絨氈層降解和花粉壁形成，為雜交水稻雄性不育的研究提供新的育種思路。

2.3 AMS 基因調(diào)節(jié)甜瓜雄性不育

甜瓜(Cucumis meloL.)是全世界廣泛種植的葫蘆科經(jīng)濟(jì)作物之一，相對(duì)于其他的園藝作物，瓜類表現(xiàn)出很大的雜種優(yōu)勢[35]。在水稻[36]、番茄[37]和辣椒[38]等作物上多個(gè)核隱性遺傳雄性不育基因已經(jīng)被精確定位，且生產(chǎn)上已有雄性不育突變體的利用，但關(guān)于甜瓜雄性不育的報(bào)道很少。

甜瓜雄性不育突變體ms5最早由美國Clause種子公司在抗白粉病品種PMR45 育種過程中發(fā)現(xiàn)，并應(yīng)用于雜交一代制種中[39]。甜瓜雄性不育(ms5)突變體候選基因AMS的定位和初步分析結(jié)果表明：AMS是其雄性不育的可能候選基因[40]。為探索甜瓜細(xì)胞核雄性不育系ms5花藥敗育發(fā)生的時(shí)期及不同時(shí)期雄花物質(zhì)含量與雄性不育之間的關(guān)系，有學(xué)者研究了不育株ms5的花藥發(fā)育結(jié)構(gòu)，且發(fā)現(xiàn)不育株可溶性糖、蛋白質(zhì)及游離脯氨酸含量均在花藥發(fā)育四分體時(shí)期出現(xiàn)明顯變化[41]。曾雙等[42]針對(duì)如何篩選出甜瓜AMS基因進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：AMS基因啟動(dòng)子在光、逆境、激素和化合物質(zhì)等相關(guān)方面都有其作用元件，并利用酵母單雜交篩選到與AMS基因啟動(dòng)子順式作用元件高度結(jié)合從而編碼甜瓜雄性不育基因表達(dá)的LOC103496635 蛋白。但關(guān)于AMS轉(zhuǎn)錄因子是如何調(diào)控甜瓜雄性不育的過程仍不是很清楚。

2.4 AMS 基因調(diào)節(jié)辣椒雄性不育

辣椒(Capsicum annuumL.)是一種重要的園藝作物。雄性不育品系的使用可實(shí)現(xiàn)高效的商業(yè)雜交辣椒種子生產(chǎn)。盡管雄性不育系已廣泛用于辣椒育種[38]，但對(duì)花粉敗育的機(jī)理知之甚少。

通過辣椒花藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析[43]，結(jié)合VIGS 基因沉默技術(shù)，篩選得到導(dǎo)致部分植株花粉敗育的辣椒育性相關(guān)基因CaAMS，該基因存在2種剪接體，CaAMS-1在單核早中期表達(dá)量最高，而CaAMS-2的最高表達(dá)量則出現(xiàn)在四分體時(shí)期。從辣椒花芽中分離并鑒定擬南芥AMS同源轉(zhuǎn)錄因子CaAMS，使用VIGS 評(píng)估CaAMS的功能[44]，發(fā)現(xiàn)在CaAMS基因沉默的花藥中，LAP5、MS1、DRL1、ABCG26和CYP703A的表達(dá)水平大大降低，辣椒花絲縮短，雄蕊干枯，花粉敗育，與擬南芥中ams突變體的表型類似。在CaAMS突變植株中，一些涉及花粉外壁合成的基因被下調(diào)，且CaAMS優(yōu)先在四倍體和單核階段的絨氈層中表達(dá)，表明CaAMS可通過調(diào)節(jié)復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)在辣椒絨氈層和花粉發(fā)育中起重要作用。

2.5 其他植物AMS 基因克隆與功能研究進(jìn)展

除上述幾種植物外，在其他植物中也有關(guān)于AMS基因的報(bào)道。對(duì)葡萄花藥發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行分析[45]，獲得在花蕾不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)差異顯著的VvAMS基因，對(duì)葡萄VvAMS進(jìn)行初步的序列分析，發(fā)現(xiàn)VvAMS基因編碼的蛋白含有bHLH.MYC-N 端結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH 轉(zhuǎn)錄因子MYC 亞家族。但是葡萄花粉敗育并不是由AMS基因突變直接引起，推測AMS基因的表達(dá)可能影響下游MS2基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致花粉敗育。而關(guān)于葡萄中AMS基因的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。袁巧玲[46]初步探討了AcAMS與洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育的關(guān)系，洋蔥遺傳體系尚未建立完善，利用VIGS 技術(shù)獲得部分不育與完全不育的轉(zhuǎn)基因植株，洋蔥AcAMS可能與細(xì)胞雄性不育有關(guān)。洋蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育系SA2 及其保持系SB2 中，AcAMS主要在洋蔥的花藥中表達(dá)，且在花粉母細(xì)胞時(shí)期和四分體時(shí)期表達(dá)差異顯著，推測由此導(dǎo)致SA2的不育。AcAMS基因與其他同源性較高的物種AMS序列分析表明：它們存在bHLH 結(jié)構(gòu)域，同源性均大于50%，表明AMS基因在物種進(jìn)化上的高度保守性。金玲等[47]克隆大豆GmAMS基因，通過GUS 融合表達(dá)分析GmAMS的時(shí)空表達(dá)，表明其主要在花藥早期表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)5 個(gè)參與花藥發(fā)育的重要互助蛋白基因(GLYMA12G18960、GLYMA20G29600、GLYMA13G32360、GLYMA10G38255和GLYMA08-G44950)。GmAMS的異常表達(dá)影響其他花發(fā)育關(guān)鍵基因的表達(dá)，繼而影響大豆花粉的正常發(fā)育。

3 展望

目前在不同植物中鑒定出的AMS具有高度的保守性，其在植物花藥發(fā)育調(diào)控上起著至關(guān)重要的作用，與植物花粉敗育密切相關(guān)。絨氈層發(fā)育和小孢子母細(xì)胞的發(fā)育是花藥發(fā)育過程至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，盡管絨氈層發(fā)育的確切機(jī)制仍然有待闡明，但已經(jīng)鑒定出與絨氈層形成、發(fā)育和程序性細(xì)胞死亡(PCD)有關(guān)的幾種基因，綜合以上AMS基因的相關(guān)報(bào)道可知：AMS突變體的絨氈層細(xì)胞和中層細(xì)胞在小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)擴(kuò)張，進(jìn)而阻止正常的細(xì)胞程序性死亡(PCD)，影響小孢子母細(xì)胞發(fā)育過程，花粉外壁不能正常發(fā)育，花粉形成異常，最終導(dǎo)致植株的雄性不育。目前在擬南芥和水稻上的研究比較深入，兩者具有很高的相似性，已有基本的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，擬南芥：DYT1-TDF1-AMS-MYB80-MS1[23]，水 稻：DsMADS3-MSP1-UDT1-TDR-EAT1-OsAP25/37[48]。系統(tǒng)發(fā)育分析支持?jǐn)M南芥DYT1和水稻UDT1基因?qū)儆谕环种В跍p數(shù)分裂和絨氈層程序死亡中擔(dān)任關(guān)鍵的角色[20]。因此，水稻UDT1-TDR基因和擬南芥DYT1-AMS基因很可能代表對(duì)正?；ㄋ幇l(fā)育至關(guān)重要的進(jìn)化保守調(diào)控通路。而對(duì)甜瓜和辣椒的研究較淺，AMS可能只間接調(diào)節(jié)甜瓜雄性不育，目前未有深入研究，應(yīng)進(jìn)一步研究以確定AMS轉(zhuǎn)錄因子的遺傳功能。辣椒的研究結(jié)果表明：CaAMS通過調(diào)節(jié)復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)在辣椒絨氈層和花粉發(fā)育中起重要作用，這更進(jìn)一步明確了AMS基因在不同物種中的相似調(diào)控。在洋蔥、大豆和葡萄上都進(jìn)行了AMS基因的克隆及同源序列分析，初步得出AMS與花粉敗育有關(guān)，但其具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本文綜述了AMS基因在不同植物花藥發(fā)育過程的調(diào)控作用，期望通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)來創(chuàng)制和篩選突變體，進(jìn)一步解析AMS在整個(gè)花藥發(fā)育過程中的分子機(jī)制，為植物雄性不育新種質(zhì)的選育提供理論指導(dǎo)。