李 靜，朱 霞，賈衛(wèi)華，王孝蕓

（1.太原鋼鐵(集團(tuán))有限公司總醫(yī)院呼吸科，太原 030003；2.四川省西南醫(yī)科大學(xué)炎癥變態(tài)實(shí)驗(yàn)室，瀘州 646000）

支氣管哮喘（哮喘）是一種最常見(jiàn)的慢性疾病之一[1-2]。調(diào)查顯示，當(dāng)今全球哮喘患者已達(dá)3 億人左右。哮喘的發(fā)病率隨著地球大氣污染的加重而逐年上升，對(duì)人們的生命健康存在很大的威脅。哮喘患者氣道存在炎癥及氣道重構(gòu)[3]。Antonio Ca?as等[4]研究顯示，氣道高反應(yīng)性是由氣道慢性變應(yīng)性炎癥和氣道重構(gòu)所致，其中氣道重構(gòu)為主要因素。變應(yīng)性炎癥主要是由于嗜酸性細(xì)胞（EOS）為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且EOS 可促進(jìn)炎癥的發(fā)展，在哮喘發(fā)生中占主導(dǎo)作用。在很多細(xì)胞中都有EOS 趨化因子（eotaxin/EOT）的存在，并且在EOS中發(fā)揮巨大的作用[5-6]?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組結(jié)構(gòu)相似的基質(zhì)降解蛋白酶家族，可降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種蛋白成分，目前MMPs 被分為23 種。有研究顯示，MMP-1可能參與氣道平滑肌重塑[7-8]。血清MMP-9作為常見(jiàn)的氣道纖維化生物標(biāo)志物，可反映氣道修復(fù)及重塑過(guò)程[9]。但目前關(guān)于MMP-9 對(duì)哮喘平滑肌重塑影響的研究較少。本研究旨在探討沙丁胺醇對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥、EOS 凋亡以及肺組織MMP-9表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 40 只SPF 級(jí)健康Wistar 雌性大鼠購(gòu)自南京君科生物工程有限公司。體重200～250 g，室溫下正常飲水?dāng)z食，所有大鼠適應(yīng)新環(huán)境1周。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組、沙丁胺醇組和地塞米松組，每組10只。

1.2 試劑與儀器 卵清蛋白（OVA，IV級(jí)）購(gòu)自Sigma 公司；胰蛋白酶和HEPES 購(gòu)自Biosharp 公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；MMP-9抗體購(gòu)自Abcam公司；甲醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自安徽嘉文儀器裝備有限公司；DAB染色液購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 動(dòng)物模型制備及藥物干預(yù) 采用腹腔注射OVA 及霧化激發(fā)的方法制作哮喘大鼠模型。各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開(kāi)始造模。在造模的第1、第8天，對(duì)哮喘組、沙丁胺醇組和地塞米松組腹腔注射含1%OVA 0.25 mL的生理鹽水以致敏，對(duì)照組給予等量生理鹽水。自第9 天起，給予1%OVA 霧化以激發(fā)哮喘，對(duì)照組給予等容積生理鹽水霧化，30 min/次，隔天1次，連續(xù)2周。在霧化激發(fā)時(shí)，大鼠出現(xiàn)了不同程度的噴嚏、喘息、呼吸急促，甚至四肢抽搐等癥狀，為造模成功。沙丁胺醇組予沙丁胺醇霧化吸入，含量為0.32 mg/mL，并用等量的生理鹽水灌胃；地塞米松組予地塞米松注射液灌胃，含量為1.2 mg/kg·d-1，對(duì)照組和哮喘組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)干預(yù)2周。

1.4 標(biāo)本采集和蘇木精－伊紅（HE）染色 在最后1 次激發(fā)后的1 天，將所有大鼠用含量為1%的戊巴比妥鈉麻醉，固定到手術(shù)臺(tái)，開(kāi)胸，結(jié)扎右側(cè)主支氣管，將右肺組織取出，將右肺的1/3 固定到4%甲醛中24 h。常規(guī)石蠟包埋，切片，采用HE 染色法染色，在400倍的顯微鏡下觀察大鼠肺組織形態(tài)。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠EOS凋亡 將大鼠用1%的戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔麻醉后，立即經(jīng)氣管注入4 ℃D-Hanks 液5 mL，輕輕按摩胸部20～30 s 后，回收支氣管肺泡灌洗液（BALF），共3 次，回收率＞90%?；厥盏腂ALF 以1 800 r/min 離心20 min，收集中間層及沉淀細(xì)胞，EOS 純度達(dá)95%以上，立即放于-80 ℃冰箱凍存。純化的EOS懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，800 r/min×5 min 離心，用100 μL預(yù)冷1×PBS重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC和PI各1 μL，輕輕搖勻后置于4 ℃下避光染色10 min 后采用流式細(xì)胞儀分析EOS細(xì)胞凋亡率。

1.6 免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織MMP-9和金屬蛋白酶組織抑制因子1(TIMP-1)蛋白表達(dá) 將左肺組織浸泡在10%福爾馬林溶液中48 h 以上，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，以?xún)?nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉，并在修復(fù)后加入抗體MMP-9和TIMP-1，第二天再將生物素加入其中顯色，封片并觀察。用專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行分析并記錄，計(jì)算其蛋白陽(yáng)性率。

1.7 Western blot 法檢 測(cè)MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá) 取100 mg 肺組織，采用RIPA 裂解液BCA 法檢測(cè)總蛋白濃度。具體方法：采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，每孔為50 μg 總蛋白，分離轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%的脫脂奶粉，封閉2 h。TBST 洗滌分別用在加入一抗（1∶3 000）前和二抗（1∶1 000）后，孵化溫度分別為4 ℃和22 ℃左右，孵化時(shí)長(zhǎng)分別為24 h 和1 h，孵化完成后洗膜，ECL 彰顯曝光。采用凝膠圖象處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer 軟件）分析目標(biāo)條帶的光密度值，計(jì)算MMP-9 和TIMP-1 蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA 表達(dá) 采用Trizol 法提取總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所得cDNA 在熒光定量實(shí)時(shí)PCR 儀（7300 RealTime PCR System，Applied Biosystem）上進(jìn)行反應(yīng)。按照說(shuō)明使用Power SYBR GreenPCR MasterMix 試劑盒，以1 LcD-NA 為模板，β-actin 為內(nèi)參照，PCR 擴(kuò)增基因片斷。PCR 反應(yīng)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火和延伸20 s，7 ℃25 s，共35個(gè)循環(huán)，在延伸的過(guò)程中搜集熒光信號(hào)。于每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置無(wú)cDNA 的陰性對(duì)照，將PCR產(chǎn)物做熔解曲線，以證實(shí)以上PCR 反應(yīng)產(chǎn)物特異性良好。采用7300 System SDS Software 分析數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算MMP-9和TIMP-1相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組氣道組織病理學(xué)變化情況 對(duì)照組氣道黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，管腔規(guī)則有序，無(wú)炎癥浸潤(rùn)；哮喘組氣道壁增厚且黏膜上皮褶皺增多，管腔變窄并可見(jiàn)大量黏液堵塞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；與哮喘組比較，沙丁胺醇組和地塞米松組病理學(xué)改變明顯減輕，見(jiàn)圖1。

2.2 4組大鼠EOS凋亡情況比較 與對(duì)照組比較，哮喘組EOS凋亡率顯著升高。與哮喘組比較，地塞米松組和沙丁胺醇組EOS 凋亡率顯著降低（P＜0.05），且沙丁胺醇組EOS凋亡率明顯低于地塞米松組（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖1 4組氣道組織HE染色病理學(xué)變化情況（×400）

圖2 4組EOS細(xì)胞凋亡情況及凋亡率比較

2.3 4組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，哮喘組MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；與哮喘組比較，地塞米松組和沙丁胺醇組MMP-9 和TIMP-1 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且沙丁胺醇組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)明顯低于地塞米松組（P＜0.05），見(jiàn)表2和圖3、圖4。

2.4 4組MMP-9 mRNA 和TIMP-1 mRNA 表達(dá)比較 與哮喘組比較，地塞米松組和沙丁胺醇組MMP-9 mRNA和TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），且沙丁胺 醇組MMP-9mRNA 和TIMP-1 mRNA表達(dá)明顯低于地塞米松組（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

表2 4組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)比較 %，

表2 4組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)比較 %，

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與哮喘組比較，bP＜0.05；與沙丁胺醇組比較，cP＜0.05。

圖3 4組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)情況

圖4 4組MMP-9和TIMP-1蛋白表達(dá)情況比較

圖5 4組MMP-9mRNA和TIMP-1 mRNA表達(dá)情況比較

3 討論

哮喘是多種炎性細(xì)胞共同參與的慢性炎癥疾病。慢性炎癥使氣道產(chǎn)生高反應(yīng)，出現(xiàn)可逆性氣流受限，導(dǎo)致患者反復(fù)出現(xiàn)喘息、胸悶、氣急等癥狀[10]。哮喘患者多在清晨和夜間發(fā)病且癥狀加重。因此，探尋哮喘的發(fā)病原因以及尋找合適的治療藥物十分重要。

Lehmann等[11]研究認(rèn)為哮喘的發(fā)病過(guò)程是一個(gè)典型的IgE介導(dǎo)的T型變態(tài)反應(yīng)，和體內(nèi)炎性細(xì)胞、炎性細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子以及炎性介質(zhì)有著密不可分的關(guān)系。本研究通過(guò)建立哮喘大鼠模型發(fā)現(xiàn)，哮喘組大鼠的氣道壁增厚，管腔變窄并可見(jiàn)大量黏液堵塞，且大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；沙丁胺醇組和地塞米松組大鼠用藥干預(yù)后情況明顯改變。哮喘發(fā)病的主要原因是氣道炎癥增多，導(dǎo)致氣道內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞，這些炎性細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)炎癥發(fā)生，導(dǎo)致人體器官發(fā)生多種炎癥反應(yīng)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，死于哮喘的患者中，多數(shù)死者的管腔都被黏液堵塞，因此，導(dǎo)致重癥哮喘患者死亡的主要原因可能為氣道黏液過(guò)多分泌導(dǎo)致氣道堵塞。

EOS作為重要的炎性細(xì)胞因子，在哮喘的發(fā)病中有著重要的作用。EOS形成于骨髓中，成熟后遷移到外周血，與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用后在氣道組織中聚集，發(fā)生氣道高反應(yīng)性[13-14]。相關(guān)研究表明，哮喘患者骨髓、外周血以及肺葉組織中EOS數(shù)量均顯著高于正常者[15]。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道，在哮喘患者支氣管組織、肺泡灌洗液中EOS 凋亡并不明顯，而患者癥狀改善后，EOS 的數(shù)量保持平衡狀態(tài)[16]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，哮喘組EOS 細(xì)胞凋亡率明顯升高；經(jīng)過(guò)地塞米松和沙丁胺醇處理后，EOS細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），沙丁胺醇可能通過(guò)調(diào)控EOS 的數(shù)量，降低毒性蛋白的釋放，緩解炎癥反應(yīng)。

有研究顯示，氣道重構(gòu)是哮喘最有特征性的病理改變，其中細(xì)胞外基質(zhì)沉淀是很重要的組織學(xué)改變[17-18]。MMP-9和TIMP-1在正常狀態(tài)下平衡存在，但在哮喘狀態(tài)中，MMP-9 的表達(dá)高于正常狀態(tài)。MMP-9可加快炎癥的發(fā)展。TIMP-1作為MMPs的抑制劑，可以有效抑制MMP-9 表達(dá)增多，因此可阻斷TIMP-1 表達(dá)增加，在哮喘發(fā)生時(shí)可抑制MMP-9的發(fā)展，從而抑制炎癥的遷移[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，組織重構(gòu)是由于MMP-9 和TIMP-1 的比例失衡所導(dǎo)致，因此抑制氣道重構(gòu)對(duì)哮喘的治療有很大的幫助[20]。本研究通過(guò)免疫組化、Western blot 及qPCR3種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，哮喘組MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)明顯增高；和哮喘組比較，地塞米松組和沙丁胺醇組MMP-9 和TIMP-1 表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。由此推測(cè)，沙丁胺醇及地塞米松可通過(guò)降低TIMP-1 和MMP-9 的表達(dá)，從而達(dá)到阻止氣道重構(gòu)的目的，且沙丁胺醇效果更佳。

綜上所述，沙丁胺醇可減少哮喘引起的氣道炎癥，并維持EOS 數(shù)目平衡，以及減少肺組織MMP-9的表達(dá)，從而對(duì)哮喘的發(fā)生和治療有一定的作用。但沙丁胺醇作為短效受體激動(dòng)劑，可能對(duì)氣道炎癥的緩解效果有限，不宜作為長(zhǎng)期用藥。