李金壟，梁晉華，張真強，王 可

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，南寧 530021）

膿胸是胸膜間隙內(nèi)膿液的積聚，通常為肺部感染繼發(fā)肺旁積液的并發(fā)癥。盡管醫(yī)療進步，膿胸依然與高發(fā)病率和死亡率有關，大約有10%～20%的膿胸患者接受了適當?shù)尼t(yī)療治療，最后仍然死亡[1-3]。膿胸的主要細菌包括有金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和化膿性鏈球菌等[4]，其中金黃色葡萄球菌是全世界報告的最常見的膿胸感染微生物[1,5]。膿胸的治療是多樣化的，胸腔引流和纖融治療是膿胸常見的治療方法[1,6-8]。然而，有研究表明，即使胸腔引流聯(lián)合抗生素治療膿胸，胸腔引流依然有一定的治療失敗率[9-10]。一方面，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，致病菌耐藥性在不斷增加；另一方面，膿胸患者住院時間長，胸腔引流管放置時間較長，可能引起引流管類似于血管移植物上的細菌生長[11-12]。

膿胸的標準治療由抗生素和胸腔積液的引流組成；當膿毒癥和感染性胸腔積液得不到有效控制時，需要進行手術。數(shù)據(jù)表明，胸膜內(nèi)給藥纖溶藥物通過切割胸膜內(nèi)纖維蛋白間隔和改善胸管引流可以減少失敗的引流和隨后的手術頻率[13-14]。此外，胸膜間隙中細胞外DNA和其他細菌成分的存在可能增加胸腔積液黏度，應用脫氧核糖核酸酶I（DNase I）可能會改善這種情況[15]。因此，本實驗選用金黃色葡萄球菌作為實驗菌株，通過建立金黃色葡萄球菌新西蘭兔膿胸模型，進一步探究尿激酶和DNase I對胸腔內(nèi)粘連和纖維蛋白形成的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 普通級雄性新西蘭兔16 只，體重2.2～2.8 kg，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK 桂2014-0003，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂2014-0002。飼養(yǎng)條件：室溫25 ℃，適宜濕度，空氣流通，動物自由攝食、飲水。本研究符合廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會所制定的倫理學標準。

1.2 主要儀器和試劑 LB 肉湯（北京陸橋公司）；LB 瓊脂粉（北京陸橋公司）；蘇木精－伊紅（HE）染色試劑盒（索萊寶）；戊巴比妥鈉（SIGMA）；多功能酶標儀（Thermo Fisher 3020）；一次性輸液用頭皮針管（湖南康利萊醫(yī)療器械有限公司）；冷凍離心機（HERMLE Z326K）；超低溫冰箱（Thermo 995），漩渦振蕩器；分光光度計（普析通用T6）；超凈臺（蘇州凈化）；生物安全柜（蘇凈安泰BHC-1300IIA2）；生化培養(yǎng)箱（恒宇SPX-300-II）。

1.3 菌液的制備 本實驗所用菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923，儲存于含25%甘油的LB 肉湯培養(yǎng)基中，置于-80 ℃冰箱保存。挑取部分-80 ℃菌液接種至LB瓊脂培養(yǎng)皿中，37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h。然后挑取單個菌落接種于LB 肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃，210 r/min搖床過夜培養(yǎng)14～16 h。低溫離心機3 000 r/min離心15 min，棄上清液，使用PBS緩沖溶液洗滌，重復3 次。調(diào)OD450=0.550（菌量為109CFU/mL），用LB 肉湯稀釋成108CFU/mL，使用菌落計數(shù)法驗證菌液濃度。

1.4 實驗分組及新西蘭兔膿胸模型的建立 將16只新西蘭兔隨機分為實驗組（n=6）、用藥組（n=6）和對照組（n=4）。實驗組新西蘭兔在耳緣靜脈注射2%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉新西蘭兔，左側(cè)臥位固定，剃毛備皮，定位于右側(cè)胸壁第6肋間脊柱前2～3 cm，碘伏消毒鋪巾，皮膚切口約1 cm，通過鑷子進行穿刺，置入剪除針頭的6號滅菌一次性輸液針管，觀察導管是否隨呼吸運動以證實導管是否進入胸腔。用無菌注射器抽氣，排出穿刺時可能進入胸腔的氣體，然后胸腔按2 mL/kg 體重注入108CFU/mL上述菌液，并再注入1 mL 無菌生理鹽水沖洗導管。將輸液針管去除蓋帽端后置入胸腔內(nèi)，縫合穿刺部位皮膚。待兔子蘇醒后送回普通級飼養(yǎng)區(qū)兔籠，給予水和食物。用藥組注入菌液后，再向胸腔注入1 mg DNase I（上海，索萊寶生物科技有限公司，D8071-25，25 mg）和4 mg 尿激酶（上海，昀冠生物科技有限公司，U108373-10，10 mg）；對照組新西蘭兔右側(cè)胸腔注入2 mL/kg的LB肉湯，其它操作與實驗組一致。

1.5 動物處理 實驗第4 天，所有實驗動物均經(jīng)耳緣靜脈滴注戊巴比妥致死。觀察兔子胸腔大體觀，無菌操作下取樣，收集胸腔積液、胸膜組織及胸腔引流管。

1.6 膿胸模型的驗證 取胸腔積液，分析胸腔積液中的白細胞數(shù)、乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖和pH值（深圳邁瑞生化分析儀BS-2000）。金黃色葡萄球菌膿胸模型建立標準：胸腔積液標本明顯化膿，革蘭染色陽性，或葡萄糖＜2.3 mmol/L（正常范圍：4.1～5.9 mmol/L）、pH＜7.10、LDH＞1 000 U/L。

1.7 胸膜粘連評分 由兩位不知實驗分組的人員進行胸膜評分：0分：正常肺和胸膜腔；1分：臟、壁層胸膜間1～3條粘連條帶；2分：胸膜腔內(nèi)3條以上粘連條帶，或少量纖維蛋白沉積；3 分：胸膜腔內(nèi)多處區(qū)域散在粘連條帶，或存在較多纖維蛋白沉積；4分：胸膜腔因粘連而閉合（分離出血），或存在大量纖維蛋白沉積。

1.8 胸膜病理檢查 取各組右側(cè)胸腔膈肌層胸膜組織，10%甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，行HE 染色，光鏡下觀察胸膜病理變化，并測定胸膜厚度。

1.9 胸腔留置導管的處理 開胸后，使用滅菌器械剪開取出胸腔內(nèi)留置導管，無菌生理鹽水沖洗導管內(nèi)外表面，并去除導管表面黏附物。每個樣本取3 cm長的導管，剪成小段，放入裝有2 mL生理鹽水的無菌試管中，使用漩渦震蕩儀震蕩10 min，取導管震蕩液稀釋100倍或1 000倍后稀釋涂盤，培養(yǎng)24 h后進行活菌計數(shù)，結(jié)果記作lg（CFU/mL）。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膿胸模型評估 3組均無動物死亡。實驗期間，與對照組相比，實驗組飲食和飲水稍減少，排便正常，精神萎靡，活動減少；用藥組無明顯變化。本研究建立膿胸模型12只，術后4 d抽取胸腔積液，實驗組胸腔積液混濁，革蘭染色發(fā)現(xiàn)陽性菌，胸膜腔內(nèi)較多纖維蛋白沉積，胸膜腔內(nèi)大量粘連條帶；用藥組胸腔積液稍混濁、量少，革蘭染色發(fā)現(xiàn)陽性菌，胸膜腔內(nèi)纖維蛋白沉積和粘連條帶明顯減少。實驗組和用藥組胸腔積液pH＜7.1，LDH＞1 000 U/L，符合膿胸標準。對照組胸腔內(nèi)無明顯胸腔積液、膿絮狀物及粘連，胸膜表面光滑，見圖1。

2.2 實驗組和用藥組胸腔積液各指標比較 用藥組白細胞數(shù)顯著少于實驗組（P＜0.05），兩組LDH、葡萄糖和pH 值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 實驗組和用藥組胸腔積液各指標比較

表1 實驗組和用藥組胸腔積液各指標比較

與實驗組比較，*P＜0.05。

2.3 3組胸膜粘連評分和胸膜厚度比較 實驗組和用藥組胸膜粘連評分和胸膜厚度均明顯低于對照組（P＜0.05），用藥組胸膜粘連評分和胸膜厚度均明顯低于實驗組（P＜0.05），見表2。

表2 3組胸膜粘連評分和胸膜厚度比較

表2 3組胸膜粘連評分和胸膜厚度比較

與實驗組比較，aP＜0.05；與用藥組比較，bP＜0.05。

2.4 胸膜組織病理檢查 與對照組相比，用藥組和實驗組胸膜均不同程度增厚，并伴有炎性細胞浸潤；與用藥組比較，實驗組胸膜明顯增厚，炎性細胞浸潤明顯增加，可見較多膠原組織沉積，見圖2。

2.5 胸膜腔留置導管的菌落計數(shù) 用藥組胸膜腔內(nèi)導管菌落數(shù)量（4.7±0.48）與實驗組（5.12±1.01）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組胸膜腔內(nèi)導管未培養(yǎng)出細菌。

圖2 新西蘭兔膿胸膈肌面胸膜HE染色圖（×100）

3 討論

國外關于膿胸動物模型研究已有大量報道，多數(shù)應用新西蘭兔進行實驗，因為目前誘導膿胸形成多數(shù)必須先人為造成無菌性炎癥，小型動物(如小鼠和大鼠)往往無法耐受，在膿胸形成之前即死亡。兔體形稍大，對炎癥有較好的耐受性[16]。因此，本研究選用新西蘭兔作為實驗動物。此外，也有文獻報道用兔致病菌巴斯德桿菌直接誘導膿胸，然而該模型多用于膿胸診斷和治療的研究，難以用于其他細菌與膿胸的相關研究[17]。本研究建立了一種引流管相關的金黃色葡萄球菌膿胸模型，為進一步研究金黃色葡萄球菌與膿胸及引流管之間的發(fā)生和發(fā)展提供可能。

在之前的研究中，筆者用銅綠假單胞菌成功建立了引流管相關膿胸模型[18]，本實驗采用了類似的方法。該模型的主要優(yōu)勢：（1）膿胸的形成是一致性的，無需先誘導無菌性胸膜炎；（2）金黃色葡萄球菌是引起人膿胸的主要致病菌，也是兔子的常見致病菌，符合臨床實際情況；（3）本研究可以對胸腔導管進行研究，為臨床研究細菌和胸腔引流管之間的密切關系提供了可能。盡管實驗中所使用的金黃色葡萄球菌是強力致病菌，但在不使用抗生素的情況下，兔子依然能夠存活并形成膿胸。

在最初的試驗中，筆者嘗試了在胸膜間隙放置引流管，然后將其固定在肩胛區(qū)的皮下組織中，但是失敗了。一方面，可能形成大量纖維蛋白隔膜，阻礙積液的引流，也阻止穿刺傷口的愈合，增加污染機會，使兔子死亡率增加；另一方面，體外留置引流管不利于兔子管理，兔子可撕咬導管而造成導管脫出，而固定兔頭影響其正常生活導致兔子更易死亡。因此，實驗中筆者將引流管完全置入胸腔中以模擬胸腔引流導管長時間留置，觀察引流管在膿胸胸腔中的情況。

已有研究表明，在長期留置于體內(nèi)的替代性治療移植物中存在大量的細菌[19]，且在多數(shù)動物模型中均已證實了這一點，這與本研究的結(jié)果一致。實驗處死兔子后，筆者將胸腔內(nèi)導管取出，用生理鹽水沖洗導管內(nèi)外表面。然后，取部分導管剪碎放入生理鹽水中，將其震蕩，用該生理鹽水進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)震蕩后液體中可培養(yǎng)出大量細菌，證明了膿胸中金黃色葡萄球菌能夠黏附在導管上生長。在臨床上，部分進行閉式胸腔引流治療的患者會出現(xiàn)遷延不愈，甚至發(fā)展為慢性膿胸的情況，這除了與患者自身的生理狀況和耐藥金黃色葡萄球菌等有關外，是否也與金黃色葡萄球菌能夠在導管表面黏附生存有關，這一點尚未有明確報道。對于膿胸中引流管表面存在的細菌能夠存活多久，筆者進行了一次試驗，發(fā)現(xiàn)即使在造成膿胸后60 d導管表面仍然存在有大量細菌，而此時胸腔內(nèi)部感染已基本被清除了。提示引流管可能為細菌提供了一個庇護所，使細菌能夠躲避宿主的免疫清除，進而長期存活于宿主體內(nèi)。

最后，筆者利用該兔膿胸模型研究了尿激酶和DNase I 聯(lián)合應用對兔膿胸的影響。自1940年以來，針對膿胸的纖溶治療一直被提倡，并且仍然是當今膿胸治療武器的一部分[20]。然而，2005年的一項研究評估了鏈激酶治療膿胸的臨床相關終點，發(fā)現(xiàn)鏈激酶在死亡率、手術率、影像學結(jié)果或住院時間方面均無益處[21]，而另一項在兒科膿胸患者中進行的隨機研究表明，采用尿激酶纖溶酶原激活劑進行胸膜腔內(nèi)纖溶治療的效果與胸腔鏡一樣好[22]。另一方面，DNase I 可以減少細胞外DNA 和其它細菌成分，從而降低胸腔積液的黏度[15]，常與纖溶酶原激活劑聯(lián)合用于治療膿胸。國外關于纖溶酶原激活劑聯(lián)合DNase 治療膿胸已有較多報道，通常應用的是阿替普酶。因此，本實驗選用了尿激酶，觀察其聯(lián)合DNase 治療兔膿胸的療效。本研究發(fā)現(xiàn)這兩種藥物聯(lián)合應用確實可以有效的減少纖維蛋白的沉積和胸膜粘連。然而，遺憾地是，聯(lián)合應用尿激酶和DNase I似乎并未能有效減少胸膜腔留置導管上的細菌量，對膿胸相關的胸腔積液也未發(fā)現(xiàn)明確的作用意義。在本次膿胸模型中，尿激酶聯(lián)合DNase治療觀查到了明顯的胸膜厚度和炎癥減輕，然而Idell等[13]關于尿激酶治療膿胸的研究認為尿激酶并不能使膿胸相關的胸膜厚度和胸膜皮減輕。筆者認為造成這種差異的可能原因是治療方案并不完全相同，筆者采用的是尿激酶聯(lián)合DNase，而Idell等[13]單用尿激酶治療。

本研究存在的局限性：本研究模型與多數(shù)膿胸患者的通常情況不同，因為大多數(shù)膿胸患者都具有潛在的肺炎，而在本模型中，原發(fā)感染在胸膜腔內(nèi)；本研究動物樣本量較少；本次實驗僅對尿激酶和DNase I的聯(lián)合應用進行了研究，未設置單用尿激酶或DNase I 的對比研究，這兩種藥物對膿胸的具體效用仍有待研究。

綜上所述，通過向新西蘭兔胸腔中直接注入高濃度金黃色葡萄球菌懸浮液，并植入引流管，成功建立了金黃色葡萄球菌新西蘭兔膿胸模型，并證實了引流管上存在大量細菌；早期尿激酶和DNase I聯(lián)合干預膿胸可以有效減少胸膜腔內(nèi)纖維蛋白沉積和粘連。