呂莉琴 ，張曉麗，李學余，鄧翎潔，潘偉程，周熙穎，陸燁彬，韋昌強，龐麗紅△，馮春泉

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷與遺傳病診斷科，南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，南寧 530012）

稽留流產(chǎn)（missed abortion,MA）是指胚胎或胎兒已死亡并滯留在子宮腔內(nèi)，未能及時自然排出，早期妊娠稽留流產(chǎn)是指妊娠≤12 周的稽留流產(chǎn)[1]?；袅鳟a(chǎn)在我國發(fā)生率高達13.4%[2]，其發(fā)病因素復雜,目前研究認為其與胚胎染色體、內(nèi)分泌、細胞凋亡異常、子宮胎盤循環(huán)障礙、感染、免疫、環(huán)境等因素有關(guān)[3]，但仍有40%～50%的稽留流產(chǎn)的原因不明。盡管現(xiàn)有研究已經(jīng)證實，多種因素參與了稽留流產(chǎn)發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，但具體機制如何尚不清楚。血管生成在胚胎發(fā)育、傷口愈合、炎癥和繁殖中起著至關(guān)重要的作用[4]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可調(diào)控血管生成的各個階段[5]。本課題組前期通過收集胚胎停育患者和非醫(yī)學原因選擇流產(chǎn)患者的絨毛組織進行全轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)一系列與胚胎停育相關(guān)的miRNAs[6]，其中miR-362-3p 表達上調(diào)，通過在線網(wǎng)站TargetScan7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/) 和 ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預測miR-362-3p 靶基因，并與測序數(shù)據(jù)mRNA 中與血管生成相關(guān)的基因通過在線網(wǎng)站Draw Venn Diagram(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集，得到目的靶基因MCAM。國、內(nèi)外學者研究表明，miR-362-3p 在宮頸腺癌[7]、肝細胞癌[8]、胃癌[9]和動脈粥樣硬化性冠心病[10]中表達下調(diào)，在子癇前期患者中表達上調(diào)[11]，而miR-362-3p 在稽留流產(chǎn)發(fā)生發(fā)展中的作用目前在國內(nèi)外還尚未有研究。相關(guān)研究表明，MCAM參與了多種生物過程，如發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導、細胞遷移、間充質(zhì)干細胞分化、血管生成和免疫反應[12]。本研究探討了miR-362-3p 和黑色素瘤細胞黏附分子（MCAM）在稽留流產(chǎn)患者絨毛組織中的表達及其與微血管密度(microvessel density,MVD)的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院計劃生育病區(qū)2019年8月至2020年7月妊娠早期稽留流產(chǎn)的早孕婦女30例作為稽留流產(chǎn)組，同時選取同期在該院就診的正常妊娠并自愿行人工流產(chǎn)的早孕婦女30例作為人工流產(chǎn)組?；袅鳟a(chǎn)組納入標準：孕周6～12周，符合早期妊娠稽留流產(chǎn)的診斷標準[1]。排除標準：（1）有自然流產(chǎn)史者；（2）停經(jīng)孕周與超聲孕周相差大于2 周者；（3）由遺傳、支原體或衣原體感染等因素引起的稽留流產(chǎn)患者；（4）合并明顯肝腎功能不全、心、腦血管疾病者；（5）合并惡性腫瘤者；（6）合并血液或免疫系統(tǒng)疾病者；（7）合并精神系統(tǒng)疾病者。人工流產(chǎn)組選擇生育能力正常、非醫(yī)學原因選擇流產(chǎn)的孕婦，無流產(chǎn)征兆及體征，無自然流產(chǎn)史，術(shù)前3～4 d內(nèi)超聲見胎心搏動，孕周以超聲確定。兩組研究對象的年齡、孕周、體質(zhì)指數(shù)（Ibm）、既往妊娠次數(shù)、分娩次數(shù)及人工流產(chǎn)次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

表1 兩組一般資料比較

表1 兩組一般資料比較

1.2 人絨毛組織的收集和處理

負壓吸宮術(shù)下無菌采集患者絨毛組織標本，無菌鑷子剔除血塊，在生理鹽水中反復漂洗至無血色，每個樣本被分為2 管，1 管在液氮中保存24 h 后移至-80 ℃冰箱保存用于實時熒光定量PCR（qPCR）實驗，1 管在4%多聚甲醛中固定24 h 后實施常規(guī)脫水處理，石蠟包埋切片。

1.3 生物信息學分析

從前期胚胎停育全轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中選擇一個表達上調(diào)的基因miR-362-3p，利用在線網(wǎng)站TargetScan7.2 和ENCORI 預測miR-362-3p 靶基因，并與測序數(shù)據(jù)中與血管生成相關(guān)的mRNA 通過在線網(wǎng)站Draw Venn Diagram 取韋恩圖交集，得到目的靶基因MCAM，再運用TargetScan7.2預測miR-362-3p和MCAM的結(jié)合位點。

1.4 實驗方法

1.4.1 qPCR 檢 測miR-362-3p 和MCAM mRNA 表達 TRIZOL法（日本Takara公司）提取絨毛組織中總RNA 后測RNA 的純度和濃度，去除DNA 后將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green Master Mix（德國QIAGEN 公司）以cDNA 為模板進行擴增，最后進行PCR反應。以人β肌動蛋白（H-ACTB）用作反應內(nèi)參。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計并合成，引物序列見表2。采用2-△△Ct方法測定相對表達量。

表2 引物序列

1.4.2 免疫組織化學法（Immunohistochemical,IHC）檢測MCAM 和CD34 的表達 將石蠟標本切片后二甲苯脫蠟、95%～50%乙醇梯度水化和EDTA 緩沖液(pH 9.0)修復液高壓抗原修復處理。用過氧化物酶阻斷劑阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后，滴加封閉用羊血清封閉非特異性抗原，再分別滴加一抗MCAM(abcam，ab75769，濃度1∶500)和CD34（proteitech，14486-1-AP，濃度1∶500），置于4 ℃冰箱孵育過夜。將多余的一抗洗脫后加入即用型山羊抗兔二抗（中杉金橋，PV-9001），再使用DAB溶液顯色，經(jīng)過蘇木精復染、脫水、透明和封片等處理后顯微鏡下觀察MCAM 和CD34 的染色情況。用CD34 的表達量代表MVD。

結(jié)果判定：細胞質(zhì)或細胞膜有明顯棕黃色顆粒沉著為MCAM蛋白陽性表達，高倍鏡下按隨機數(shù)字表法選取5個400倍視野，采用Image-Pro plus 6.0分析平均光密度（average optical density，AOD）值。CD34 分布于細胞質(zhì)，以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。微血管計數(shù)參考Weidner等[13]的標準：凡標記清晰,著色強,與背景明顯有別的單個染色的血管內(nèi)皮細胞、管腔直徑小于8 個紅細胞的血管或血管內(nèi)皮細胞簇，不論是否形成管腔或管腔內(nèi)是否有紅細胞,只要不和臨近的微血管、細胞及其它結(jié)締組織相連,就作為一個微血管。管壁有平滑肌的血管不予計數(shù)。先在低倍鏡下尋找新生血管最密集區(qū),然后在200倍視野下選取5個視野,計數(shù)微血管染色數(shù)目,其平均值即該例的MVD。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson 相關(guān)分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學分析結(jié)果

TargetScan7.2和ENCORI分別預測到miR-362-3p 的靶基因各359 和3 502 個，再與前期測序數(shù)據(jù)mRNA中與血管生成相關(guān)的25個基因取交集，最終得到一個交集基因MCAM，通過Targetscan7.2 數(shù)據(jù)庫分析，MCAM的3’-非翻譯區(qū)（3’-UTR）具有miR-362-3p的結(jié)合位點，見圖1。

2.2 miR-362-3P和MCAM mRNA在稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)絨毛組織中的表達

qPCR 檢測結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)組絨毛組織miR-362-3p 相對表達量（3.56±3.99）明顯高于人工流產(chǎn)絨毛組織（0.76±0.61）（P＜0.05），稽留流產(chǎn)組絨毛組織MCAM mRNA相對表達量（1.06±0.57）明顯低于人工流產(chǎn)組絨毛組織（1.47±0.62），見圖2。

2.3 MCAM在稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)絨毛組織中的蛋白表達水平

IHC檢測結(jié)果顯示，MCAM蛋白主要定位于內(nèi)皮細胞胞質(zhì)和細胞間連接處，MCAM蛋白陽性染色呈淡黃色或棕黃色。稽留流產(chǎn)組絨毛組織MCAM（0.14±0.03）蛋白表達水平明顯低于人工流產(chǎn)組絨毛組織（0.20±0.05）（P＜0.05），見圖3。

2.4 稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)絨毛組織樣本中的MVD

IHC檢測結(jié)果顯示，CD34定位表達在血管內(nèi)皮細胞的細胞質(zhì)，CD34陽性染色呈淡黃色或棕黃色，稽留流產(chǎn)組絨毛組織MVD（21.06±8.93）表達水平明顯低于人工流產(chǎn)組絨毛組織（26.76±6.03）（P＜0.05），見圖4。

2.5 稽留流產(chǎn)絨毛組織中miR-362-3p 與MCAM mRNA、MCAM表達蛋白與MVD的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)組絨毛組織中miR-362-3p相對表達量與MCAM mRNA相對表達量呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.796，P＜0.05）；MCAM蛋白表達量與MVD 呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.667，P＜0.05），見圖5。

圖1 生物信息學分析結(jié)果

圖2 miR-362-3p和MCAM mRNA在稽留流產(chǎn)和人工流產(chǎn)絨毛組織中的表達

圖3 IHC檢測MCAM蛋白表達情況（400×）

圖4 人工流產(chǎn)組及稽留流產(chǎn)組MVD檢測結(jié)果（200×）

圖5 稽留流產(chǎn)絨毛組織中miR-362-3p與MCAM mRNA、MCAM表達蛋白與MVD的相關(guān)性

3 討論

MicroRNAs (miRNAs)是一種長度為19～25 個核苷酸的短RNA 分子，通過與靶mRNA 轉(zhuǎn)錄本的3’-UTR 或其他區(qū)域結(jié)合來增加或減少蛋白表達，調(diào)節(jié)特定蛋白的表達水平，從而在健康和疾病的基因調(diào)控中發(fā)揮核心作用[14]。血管生成參與維持胚胎發(fā)育、傷口愈合、炎癥和生殖等正常生理過程。據(jù)報道，大約有33個不同miRNA家族的miRNA在血管生成中發(fā)揮作用[15]。Wang 等[11]發(fā)現(xiàn)，miR-362-3p在子癇前期患者胎盤中的表達升高，miR-362-3p上調(diào)使缺氧狀態(tài)對HTR8/SVneo 細胞的生存能力、遷移和侵襲抑制作用增強，在調(diào)節(jié)各種細胞的遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用。許多腫瘤研究顯示，miR-362-3p 對細胞增殖和侵襲具有調(diào)節(jié)作用。Christensen 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-362-3p 通過靶向E2F1、USF2和PTPN1誘導結(jié)直腸癌細胞周期阻滯，并與癌癥復發(fā)風險負相關(guān)。Zou 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-362-3p的上調(diào)抑制了腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲，提示miR-362-3p 負向調(diào)控細胞增殖和遷移。除了癌細胞外，miR-362-3p 還通過靶ADAMTS1 在動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞中作為細胞增殖和遷移的負調(diào)控因子[10]。本研究結(jié)果顯示，稽留流產(chǎn)絨毛組織中miR-362-3p 相對表達水平明顯高于人工流產(chǎn)組，而miR-362-3p 的相對表達量與MCAM mRNA 的相對表達量呈負相關(guān)關(guān)系，且MCAM 的3’-UTR 與miR-362-3p 存在結(jié)合位點，由此可以推測，miR-362-3p可能通過調(diào)控MCAM參與稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展。

最早發(fā)現(xiàn)MCAM 分子特異表達在黑色素瘤細胞上,隨后發(fā)現(xiàn)它也表達在血管內(nèi)皮細胞[18]、侵襲性中間滋養(yǎng)層細胞[19]和激活狀態(tài)T 細胞[20]等部位。MCAM是一種高度糖基化的單體，是一種跨膜免疫球蛋白超家族細胞粘附分子，參與細胞跨上皮遷移和信號轉(zhuǎn)導。它在黑色素瘤、鱗狀細胞癌、前列腺癌、卵巢癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌等組織中表達，并促進腫瘤生長、血管生成和轉(zhuǎn)移[21]。MCAM在血管系統(tǒng)、正常發(fā)育和腫瘤進展等過程中起著關(guān)鍵作用[22]。MCAM 不僅僅是細胞間和細胞基質(zhì)粘附的細胞粘附分子，最近的證據(jù)表明，MCAM 積極參與多種過程，如發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導、細胞遷移、間充質(zhì)干細胞分化、血管生成和免疫反應。MCAM已日益成為一種重要的分子，特別是作為血管生成和癌癥的一種新的生物標志物[12]。MCAM 基因被認為與惡性黑色素瘤的預后相關(guān)，其與稽留流產(chǎn)關(guān)系的研究尚未見報道。

血管生成在胚胎發(fā)育、傷口愈合、炎癥和繁殖中起著至關(guān)重要的作用[4]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)miRNA 可調(diào)控血管生成的各個階段[5]。多種調(diào)節(jié)因子和信號分子，包括血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)、成纖維細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、干擾素、基質(zhì)金屬蛋白酶1/9(MMP-1/9)都與血管生成相關(guān)[5]。首先，受精卵通過起源于錨定絨毛的細胞滋養(yǎng)細胞附著到母體子宮內(nèi)膜處，然后通過釋放多種基質(zhì)蛋白水解酶（如MMP）降解子宮內(nèi)膜處的細胞外基質(zhì)，進而穿透基底膜遷移到基底膜下肌層，即完成“間質(zhì)侵襲”[19]。金屬蛋白酶是唯一能降解胞外各類膠原蛋白的酶類,對侵襲過程非常關(guān)鍵[23]。劉琴等[24]研究發(fā)現(xiàn)，MCAM 分子在滋養(yǎng)層細胞侵襲中的功能是通過調(diào)節(jié)其分泌金屬蛋白酶的能力而實現(xiàn)的?？筂CAM抗體能抑制滋養(yǎng)層細胞分泌MMP9 和MMP2,這可能是解釋MCAM 抗體抑制滋養(yǎng)層細胞遷移的主要原因。Yan等[25]研究發(fā)現(xiàn)，單克隆抗體AA98 能識別靶抗原黏附分子MCAM，在動物實驗中,利用AA98能干擾腫瘤血管內(nèi)皮細胞分裂增生形成新的毛細血管芽,從而抑制血管生成和腫瘤的生長。本研究中，MCAM蛋白表達量在稽留流產(chǎn)組絨毛組織中下調(diào)，可能是通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的分泌，從而抑制滋養(yǎng)層細胞的侵襲，而稽留流產(chǎn)絨毛組織中MCAM蛋白表達量和MVD呈正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），MCAM在血管生成過程中可能通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶從而影響血管生成。

綜上所述，miR-362-3p 在稽留流產(chǎn)絨毛組織中表達上調(diào),可能通過調(diào)控MCAM 抑制微血管形成,在稽留流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮潛在作用。本研究為進一步探討miR-362-3p 影響稽留流產(chǎn)微血管形成的分子機制提供了重要線索，miR-362-3p 和MCAM可能成為診斷稽留流產(chǎn)新的生物標記物，關(guān)于其在稽留流產(chǎn)中的具體作用機制，還有待進一步研究。