伍鋼，韋佳塔，張玉雪，陳海蘭，劉琪琦，江明生*

(1. 廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005；2. 軍事醫(yī)學研究院輻射醫(yī)學研究所，北京 100850)

高通量測序(high-throughput sequencing, HTS)又稱“下一代”測序技術(next generation sequencing, NGS)，是2005年以后逐步推出的一系列新測序方法的統(tǒng)稱。它先從樣本中制備DNA文庫，然后采用PCR方法擴增連接接頭后的文庫并利用磁珠進行純化，再對磁珠純化后的文庫進行大規(guī)模并行測序[1]。由Roche公司開發(fā)的焦磷酸測序系統(tǒng)是市場上第一個商業(yè)化的HTS測序平臺，然后相繼出現(xiàn)了Illumina公司的Solexa平臺、Thermo Fisher公司的Ion Torrent平臺。

自從推出了第一個HTS平臺以后，測序數據質量和產量呈指數級增長，使得DNA測序在技術上更簡單、更快速、更便宜，大大加快了基因組研究的進度，使其在流行病學研究、病原檢測、疾病診斷、藥物靶點發(fā)現(xiàn)等領域的應用得以快速推廣[2-5]。

雖然HTS技術已發(fā)展得相當成熟，但其在獸醫(yī)領域的研究和應用相對較少。本文就近年來HTS在獸醫(yī)臨床中的應用進行綜述，并對其在獸醫(yī)領域的發(fā)展趨勢進行展望，旨在幫助獸醫(yī)研究和工作者更快的了解HTS技術，利用這個強大的技術解決獸醫(yī)領域的問題，促進畜牧獸醫(yī)行業(yè)的健康快速發(fā)展。

1 高通量測序技術發(fā)展現(xiàn)狀

DNA序列的測定是分子生物學研究中一項非常重要和關鍵的內容，基因的分離與定位、基因的結構與功能、基因的表達與調控、基因與疾病的關系、藥物作用靶點等研究都依賴于對DNA一級結構的詳細了解。自1977年Sanger測序問世以后，測序技術取得了巨大的發(fā)展，從第一代的化學降解法、雙脫氧鏈終止法、熒光自動測序技術和雜交測序技術，經過了第二代的Solexa測序技術、SOLiD測序技術和454測序技術，最終進入以單分子測序為特點的第三代測序時代[6]。測序讀長由長至短再到長，測序速度不斷提升，測序成本則顯著下降[7]。

1977年，Sanger采用化學降解法測定了噬菌體X174全長5 375個堿基的序列，開啟了基因組學時代[8]。2001年，美、英、法、德、日和中國6個國家采用Sanger發(fā)明的雙脫氧鏈終止法聯(lián)合完成了首個人類基因組圖譜的繪制，為人類揭開自身奧秘奠定了堅實的基礎。第一代測序是以傳統(tǒng)的鏈終止法和化學降解法為原理的DNA測序法，它的讀長可達1 000 bp，準確性高達99.999%，但其測序成本高、通量低、操作復雜和對有毒或放射性試劑的依賴，嚴重限制了它的大規(guī)模應用[9]。隨著人類基因組計劃的完成，人們進入了后基因組時代(功能基因組時代)。為了克服Sanger測序法的不足，研究者們不斷地對測序技術進行開發(fā)和改進，以尋求Sanger測序法的替代者，隨之誕生了以Roche公司的454技術、Illumina公司的Solexa和Hiseq技術為代表的第二代測序技術[10]。HTS高通量的顯著特性使其在保持高度準確性的同時極大地加快了測序進程，使核酸測序的成本明顯降低，滿足了越來越多對時間和資源要求都很苛刻的大型基因組測序項目的需求[1]。近二三年，出現(xiàn)了無需進行PCR擴增的單分子測序技術，被稱為第三代測序技術，以Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術和PacBio公司的SMRT為代表。

HTS技術的快速發(fā)展，給生命科學的研究帶來了極大的便利，被廣泛應用于新物種(亞型)發(fā)現(xiàn)、基因表達分析、非編碼小分子RNA鑒定、轉錄因子靶基因篩選、DNA-蛋白質相互作用等領域，對揭示生命本質的研究起到了關鍵的作用[11]。該技術同樣被越來越多地應用于動物品種改良指導、畜禽疾病診斷、分子流行學研究、致病機理探索、耐藥性分析等畜牧獸醫(yī)的相關研究[12]。

2 高通量測序技術在獸醫(yī)臨床上的應用

畜牧養(yǎng)殖業(yè)是關乎國民經濟發(fā)展的重要支柱產業(yè)之一，HTS是在生命科學領域強勢崛起的新型技術，在畜禽疾病診斷、疾病監(jiān)測、致病機理探索、耐藥性分析等領域逐漸展現(xiàn)其應用優(yōu)勢，表現(xiàn)出巨大的應用前景。

2.1 高通量測序技術在畜禽疾病診斷中的應用

動物傳染病是由病原微生物引起的一種具有傳染性的疫病，近年來，我國動物疫病呈現(xiàn)多發(fā)狀態(tài)，且多呈混合感染。例如，2018年暴發(fā)的非洲豬瘟(African swine fever，ASF)在短短幾個月內迅速擴散至全國，截至2019年7月底，全國31個省份暴發(fā)ASF疫情150起，其中家豬暴發(fā)146起，野豬暴發(fā)4起[13]。對病原體的快速、全面、準確鑒定，是及時制定有效的防控措施、減少疾病傳播和損失的關鍵。基于單一目標的傳統(tǒng)檢測方法耗時長且操作復雜，難以滿足動物傳染性疾病復雜、傳播快的特征，而采用HTS的宏基因組測序技術克服了多數病原體不能培養(yǎng)的限制，可準確高效地獲得病原體全部的遺傳信息，從而直接快速鑒定出病原。2016年冬季，阿拉斯加州內陸地區(qū)暴發(fā)的犬細小病毒(CPV)引起犬類發(fā)病率和死亡率明顯增加[14]。Parker等[14]通過對12只疑似感染犬細小病毒的犬的12個直腸拭子標本提取的靶向轉錄RNA進行高通量測序，發(fā)現(xiàn)發(fā)病率和死亡率的增加原因不是由于新型病毒的出現(xiàn)，而是由于未接種疫苗或疫苗接種劑量過低?；贖TS的全基因組比對分析在2014—2015年歐洲零星暴發(fā)的禽流感病毒H5N8的診斷中發(fā)揮了重要作用，Bouwstra等[15]對來自荷蘭的高致病性禽流感病毒進行了遺傳分析，并與歐洲、韓國和日本的毒株進行了比較，數據顯示病毒的傳播宿主可能是來自亞洲的候鳥。

遺傳性疾病也是嚴重威脅動物養(yǎng)殖健康發(fā)展的因素之一，HTS技術可通過基因組測序和比較基因組學分析，快速鑒定引起疾病的突變位點，改善對動物遺傳缺陷的管理和控制。為了追求更高的生產性能，優(yōu)良品種動物被大量推廣和使用，但該策略通常會引起遺傳缺陷的定期暴發(fā)。Sartelet等[16]采用全基因組關聯(lián)研究和HTS技術快速發(fā)現(xiàn)了引起比利時藍牛遺傳性關節(jié)病的31個候選點突變，其中 PIGH基因第一個內含子(c 211-10C>G)中的一個C到G轉換，預計會影響到它的受體剪接位點，轉錄翻譯產生的PIGH 蛋白缺乏必要的結構域，從而不具有生物學活性，這是引起比利時藍牛關節(jié)病的關鍵。

2.2 高通量測序技術在疾病監(jiān)測中的應用

隨著畜禽養(yǎng)殖的集約化和規(guī)?；l(fā)展，畜禽養(yǎng)殖出現(xiàn)“老病不斷、新病頻發(fā)”的現(xiàn)象。應用分子生物學理論與技術，從分子基因水平研究病因和流行因素，是國家、地方相關部門和企業(yè)主制定防控措施的依據。HTS技術可在微量條件下完成對臨床樣本中遺傳物質的擴增和分析，而不需要對病原體進行分離培養(yǎng)，不需要設計目的序列的針對性引物，不依賴病原體遺傳背景[17]，在分子流行病學中HTS技術可以作為發(fā)現(xiàn)未知病原、識別和跟蹤傳播途徑等疾病監(jiān)測的重要工具[18]。

相比于傳統(tǒng)的耗時長的未知病原的鑒定方法，如病毒分離培養(yǎng)、血清學分析、免疫電鏡觀察等，HTS技術不依賴于病原體遺傳背景和高通量的特點使其具有非常大的優(yōu)勢。Tang等[19]使用HTS技術對賓夕法尼亞州患有病毒性關節(jié)炎的肉雞中分離出的禽呼腸孤病毒(ARV)進行全基因組測序，發(fā)現(xiàn)了與常見田間毒株不同的2個新毒株，包括野外變異種(Reo/PA/Broiler/15511/13或 PA15511)和(Reo/PA/Turkey/22342/13)。Andriyan等[20]使用HTS對2006—2007年間收集的美國感染西尼羅病毒(West Nile Virus, WNV)的禽類樣品DNA進行測序，鑒定出含有13個核苷酸缺失的新遺傳變異體。Chen等[21]利用RNA-Seq在對國內家禽進行的一項調查的過程中意外發(fā)現(xiàn)了一種新的冠狀病毒。2003年荷蘭暴發(fā)的H7N7高致病性禽流感導致近3 000萬雞被捕殺、89人感染、1人死亡，調查人員采用Illumina深度測序對樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)高致病性禽流感病毒(H7N7)感染人后， PB2 E627K基因的突變頻率明顯增加[22]。

病原物種、亞型、分離株和變異株的多樣性使它們在毒力、預防接種、流行病學、診斷和治療等方面有著重要影響。HTS技術在研究病原體的遺傳多樣性與致病性之間的關系有著獨特的優(yōu)勢，例如通過獲取豬繁殖與吸吸障礙綜合征病毒(PRRSV)的完整基因組序列，或通過比較該病毒ORF5序列，可判斷暴發(fā)毒株的來源、傳播途徑和持續(xù)存在的原因[23]。Guyard-Nicodème[24]與Ohishi等[25]都采用HTS分析了人源性和雞源性空腸彎曲桿菌的分子流行病學特征，通過比較基因組學分析一致認為食用被空腸彎曲桿菌污染的雞肉是其傳染給人的主要傳播途徑。

2.3 高通量測序技術在致病機理研究中的應用

病原微生物感染宿主后，與宿主機體免疫系統(tǒng)之間的博弈通常會導致自身基因組部分位點發(fā)生變異，從而使其逃逸宿主免疫系統(tǒng)對它的攻擊和清除，從而得以生存。此外，在藥物治療過程中，病原也可能通過基因突變改變藥物作用靶點結構，或產生滅活酶或鈍化酶，或改變代謝途徑等手段來逃避藥物的作用，產生對該類藥物的耐藥性。HTS測序通過覆蓋靶基因位點數十倍甚至上百倍的深度測序，有效地展現(xiàn)病原微生物基因組發(fā)生的變化，揭示其致病機制，指導臨床防治。

臨床試驗和生產實踐中發(fā)現(xiàn)，相比于其他的禽白血病病毒(ALV)，ALV-J亞型更具致病性，但原因不明[26]。Meng等[27]因此采用HTS技術對ALV和ALV-J的基因組進行分析，發(fā)現(xiàn)ALV-J與人類免疫缺陷病毒相似，具有很高的基因重組率，更容易發(fā)生突變，從而表現(xiàn)出廣泛的遺傳多樣性[28]。寧蓬勃[7]采用HTS技術對豬瘟病毒石門株感染與未感染的SUVEC基因在轉錄水平的表達差異的研究發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒石門株可能利用改變宿主細胞復制周期、抗凋亡、抗炎癥等多種策略實現(xiàn)自身的復制增殖，并逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除。Barbosa等[29]采用HTS技術對澳大利亞考拉及考拉身上蜱蟲中的錐蟲群落進行患病率和遺傳多樣性研究，在考拉中第一次發(fā)現(xiàn)了Trypanosomanoyesi的感染，同時還發(fā)現(xiàn)了1個新的錐蟲種感染，此外得到了考拉中錐蟲感染多為2種以上甚至多達5種錐蟲的復合感染，為澳大利亞考拉錐蟲病的治療提供了依據。對豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)ORF蛋白與宿主細胞調控相關功能的鑒定，有助于更好地了解斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的發(fā)病機制。在PCV2基因組中發(fā)現(xiàn)了1個新的PCV2 ORF蛋白，即ORF5蛋白，但其在PCV2感染宿主的發(fā)病機制中的作用尚不清楚[30]。Choi等[30]使用RNA-seq技術研究PCV2 ORF5在PCV2感染豬上皮細胞中的作用，發(fā)現(xiàn)PCV2 ORF5可能通過抑制涉及Ⅰ型IFN合成的基因的轉錄從而抑制Ⅰ型干擾素(IFN)的表達，從而增強豬上皮細胞中PCV2的復制，指出PCV2 ORF5蛋白可能對宿主免疫監(jiān)測具有抑制作用。Bujold等[31]對6種不同類別的13株放線桿菌進行了比較基因組學分析，找出放線桿菌屬成員間的異同，識別放線桿菌屬某些成員侵襲機制中的決定因素，指出自轉運蛋白、唾液酸生物合成/代謝蛋白、IgA蛋白酶1可能與放線桿菌的侵襲性有關。Zysset-Burri等[32]利用HTS對致病性的福氏納格里阿米巴原蟲和非致病性納格里原蟲分別進行全基因組和轉錄組測序，再結合蛋白質組學技術分析這2種原蟲基因組的相似性和表達蛋白的差異性，確定了22個在人類原發(fā)性阿米巴腦膜炎致病機制中發(fā)揮作用的蛋白，并通過這些蛋白的功能注釋提出了細胞膜可能是這些原蟲發(fā)揮其致病潛能的主要場所的觀點。

2.4 高通量測序技術在病原耐藥性研究中的應用

抗生素的耐藥性問題已成為全世界共同面對的難題之一，據估計到2050年，全球每年將有1 000萬人死于細菌耐藥，超過目前每年死于癌癥的820萬人，直接造成的經濟損失將會達到約100萬億[33]。動物養(yǎng)殖出現(xiàn)越來越多難以控制和治療的感染性疾病，每年造成巨大經濟損失。HTS技術通過對病原微生物全基因組的高通量測序，可快速獲取耐藥基因、轉座子序列和耐藥菌進化軌跡等信息，對研究耐藥性的遺傳變化規(guī)律和耐藥機制具有重大意義[34]。銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素最常見的耐藥機制是合成SPM-1金屬β-內酰胺酶，Nascimento等[35]通過高通量測序技術對6株產SPM-1金屬β-內酰胺酶銅綠假單胞菌ST277進行測序，測序后與標準菌株基因組進行比對，一共檢測到 26個基因組島，從中發(fā)現(xiàn)了一些參與銅綠假單胞菌耐藥過程相關的基因，并且還發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)導致抗菌藥物耐藥性和毒力相關基因的氨基酸變化，為繼續(xù)深入研究銅綠假單胞菌的耐藥機制奠定了基礎。

通過高通量測序不僅可以快速鑒定出耐藥基因，還可以確定耐藥性產生的機制[36]。Binh等[37]采用HTS技術就對3種克拉霉素敏感及耐藥的幽門螺桿菌的基因組DNA進行了測序，發(fā)現(xiàn)高抗藥性致病菌內含有23S rRNA基因的A2143G點突變，同時發(fā)現(xiàn)了與克拉霉素抗藥性有關的2個新突變位點infB和rpl22。使用HTS技術對耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的研究發(fā)現(xiàn)，移動遺傳元件SCCmec可以攜帶mecA基因進入對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌內，使其獲得對甲氧西林的耐藥特性[38]。朱陣[36]采用高通量測序技術測定的福氏志賀菌基因序列與de novo 序列比對，發(fā)現(xiàn)metG、gyrB、gydA、rob、narX等多個基因序列及其他的間區(qū)均存在突變位點，其中甲硫氨酰tRNA合成酶metG和酞酰脯氨酰順反異構酶ppiA的基因位點突變與福氏志賀菌的耐藥性有關，同時還發(fā)現(xiàn)該菌種環(huán)丙沙星藥物的作用靶點gyrB基因?？琢盥擺39]利用高通量測序技術發(fā)現(xiàn)單個堿基突變的gyrA基因即可導致牛A型多殺性巴氏桿菌菌株對喹諾酮類藥物產生耐藥性，高度耐藥時gyrA基因第83位，parC第80、84位堿基同時發(fā)生點突變，這些突變抑制了藥物與細菌表面藥物作用靶位的結合；而牛A型多殺性巴氏桿菌23S rRNA第2 059位的堿基置換則引起菌株對大環(huán)內酯類藥物的耐藥。

3 前景與展望

HTS技術革新了基因組研究的格局，測序深度和分辨率的提高使基因組的探究達到了更高的層次，加深了對人類、動物和病原體基因組復雜性與動物傳染病的進化、傳播方式和致病性的理解[40]。自改革開放以來，我國的畜牧業(yè)總產值一直處于上升態(tài)勢，2017年超過3.2萬億，占農業(yè)總產值比例的30%，帶動上下游相關產業(yè)產值3萬億元以上。但畜牧業(yè)具有集中化、規(guī)?；奶攸c，容易引起病原體大規(guī)模的傳播和感染。

目前獸醫(yī)臨床上主要采用藥敏試驗、PCR等分子生物學手段對畜禽病原體耐藥菌株進行鑒定，根據鑒定結果強化病原體耐藥性監(jiān)測，減少細菌耐藥性的產生和蔓延，制定防控措施[41]。但是，藥敏試驗需要經過細菌分離培養(yǎng)才能檢測到臨床樣本里的耐藥菌株，其周期較長，培養(yǎng)條件受限制的菌株不能進行藥敏試驗[42]。多重PCR技術可直接檢測培養(yǎng)物或臨床樣本的耐藥基因，但是基于PCR的耐藥基因檢測方法只能檢測已知耐藥基因且檢測通量有限[43]。而可對大量核酸進行無差異序列測定的高通量測序技術則有很大優(yōu)勢，不但可以快速檢測出多種致病病原體，還可有效發(fā)現(xiàn)未知病原，不需要培養(yǎng)菌株就可檢測在單個樣本中同時存在的多個不同的病原體和耐藥基因[21,44]，對于細菌耐藥性臨床監(jiān)測、疾病診斷、流行病學研究及指導防控措施的制定都有著重要意義。此外，高通量測序結合生物信息學分析對病原體基因組遺傳特征的研究，可幫助科研人員預測和篩選合適的病毒抗原表位，確定可用于疫苗開發(fā)的基因序列[40,45]。HTS技術與轉錄組學、蛋白組學的結合可以在基因表達、轉錄、翻譯3個階段對致病基因位點突變的精確鑒定，可有效指導致病機理的分析，藥物作用靶點的確定和新藥的設計與開發(fā)，為后期動物傳染病的預防和治療奠定理論基礎[45]。

與常規(guī)的分子生物學檢測手段相比，HTS擁有比較大的優(yōu)勢。但HTS運行設備及試劑耗材的高昂價格，后期數據分析要求的豐富生物信息學經驗，以及HTS研究方法的標準與序列數據生成、分析、注釋和報告流程規(guī)范的缺失和不完善，極大地限制了HTS在獸醫(yī)臨床的廣泛應用[45-47]。因此，為了充分發(fā)揮HTS在畜禽疾病防治、疾病監(jiān)測、致病機理探索、耐藥性控制、藥物開發(fā)等領域中的作用，需要研制成本更低的設備，開發(fā)價格更低的配套試劑和耗材，同時提高用戶友好性和診斷實驗室的可訪問性，使非專業(yè)用戶更方便對測序結果進行分析[11]。目前測序程序在大型臨床實驗室和公共衛(wèi)生實驗室正在朝自動化的方向發(fā)展，標準化數據處理和分析也正在開發(fā)中，未來需要將測序和數據分析整合到一個有效的工作流程中，實現(xiàn)在獸醫(yī)臨床中HTS使用的全自動化[8]。在將來用戶只需要將細菌培養(yǎng)物/樣本加載到測序儀的DNA制備模塊中，無需人工交互，直接生成針對每個實驗室需求定制的標準化報告并將其存儲在實驗室信息管理系統(tǒng)(LIMS)數據庫中，提供實時的疾病監(jiān)測數據，及時制定有效防控措施[19]。

無可置疑，HTS已經給獸醫(yī)臨床工作帶來了巨大的變革。相信隨著成本的降低和技術的改進，HTS技術在獸醫(yī)臨床中勢必會成為必不可少的診斷工具并發(fā)揮舉足輕重的作用，提高疾病診斷和藥物研發(fā)的效率，促進養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展。