張?jiān)?吳佩玲,王倩云,買熱葉木姑·艾沙,阮曉慧

(新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院口腔科,烏魯木齊 830063;*通訊作者,E-mail:295923650@qq.com)

牙周病是口腔中常見的炎癥性疾病之一,導(dǎo)致牙槽骨吸收,最終使牙齒脫落,所以在牙周病的治療中,恢復(fù)缺損的牙槽骨依舊是研究的熱點(diǎn)內(nèi)容之一。近年來,隨著對新型支架材料和干細(xì)胞的研究,為牙周組織再生提供了新的思路。GO因其優(yōu)異的理化性質(zhì),成為組織工程領(lǐng)域研究與應(yīng)用的熱點(diǎn)。其作為石墨烯的衍生物之一,具有良好的生物相容性和親水性[1],高的機(jī)械強(qiáng)度,大的接觸面積等特性[2],在組織工程領(lǐng)域展現(xiàn)出應(yīng)用潛力。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),GO超過一定濃度對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[3-6],但對低濃度GO是否能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化得出的結(jié)論不同[7]。

hPDLSCs作為牙源性干細(xì)胞的一種,具有多向分化潛能,本課題組[8,9]前期研究發(fā)現(xiàn),hPDLSCs表現(xiàn)出了明顯的增殖和成骨分化能力,是牙周組織再生的理想的種子細(xì)胞。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn),將hPDLSCs與不同濃度GO共培養(yǎng),探討GO對hPDLSCs的增殖及成骨分化能力的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

氧化石墨烯分散液(江蘇先鋒納米);澳洲胎牛血清(Gibco,美國);維生素C;β-甘油磷酸鈉;地塞米松;茜素紅染色液(索萊寶生物,北京);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(博士德生物,武漢);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo,美國);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒(QIAGEN,德國)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life-Tech,美國);酶標(biāo)儀(Thermo,美國);熒光倒置顯微鏡(Leica,德國);超凈工作臺(tái)(蘇州凈化);恒溫水浴箱(上海一恒科技);正置顯微鏡;倒置顯微鏡(Leica,德國);低溫高速離心機(jī)(Eppendorf,德國)。

1.2 氧化石墨烯(graphene oxide,GO)完全培養(yǎng)基的制備

配制0,0.1,0.5,2.5,12.5,62.5 μg/ml GO完全培養(yǎng)基(含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基)和0,0.1,0.5,2.5 μg/ml GO成骨誘導(dǎo)液(10% FBS、10 mmol/L β-甘油酸鈉、50 mg/L維生素C及10 nmol/L地塞米松的α-MEM培養(yǎng)基)。

1.3 hPDLSCs復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代

hPDLSCs由課題組前期構(gòu)建,復(fù)蘇第2代凍存hPDLSC,放入培養(yǎng)條件為37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度的恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度為80%-90%時(shí),用2.5 g/L胰蛋白酶消化及傳代,采用第3-4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 倒置顯微鏡觀察hPDLSCs的細(xì)胞形態(tài)

將hPDLSCs用2.5 g/L胰蛋白酶常規(guī)消化為細(xì)胞懸液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),將細(xì)胞密度調(diào)整為1×103/孔,接種于6孔板中,24 h細(xì)胞貼壁后分別加入不同GO濃度完全培養(yǎng)基對細(xì)胞培養(yǎng),于恒溫箱培養(yǎng)72 h,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒法(CCK-8)檢測hPDLSCs增殖

將對數(shù)生長期的hPDLSCs常規(guī)消化為細(xì)胞懸液,以1×103/孔的密度接種于4塊96孔培養(yǎng)板中,置于恒溫箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后,棄去原培養(yǎng)基,換為不同GO濃度完全培養(yǎng)基對細(xì)胞培養(yǎng),每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別在1,3,5,7 d隨機(jī)取出一塊96孔板終止培養(yǎng),用磷酸鹽緩沖液清洗3次,加入10 μl CCK-8液,置于恒溫箱中孵育2 h,在推薦波長490 nm下測定吸光度(OD),另設(shè)波長630 nm為參考波長。

1.6 hPDLSCs成骨分化能力的測定

1.6.1 茜素紅染色法檢測hPDLSCs礦化情況 將對數(shù)生長期的hPDLSCs常規(guī)消化為細(xì)胞懸液,以1×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔板,在恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%-60%棄去原培養(yǎng)基,換為含0,0.1,0.5,2.5 μg/ml GO的成骨誘導(dǎo)液對細(xì)胞培養(yǎng),每3 d換液1次,培養(yǎng)到第14天時(shí)行茜素紅染色,于倒置顯微鏡下觀察各組礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成骨標(biāo)志基因的表達(dá) 將對數(shù)生長期的hPDLSCs常規(guī)消化制成細(xì)胞懸液,以2×105個(gè)/孔的濃度接種于6孔板,換為含0,0.1,0.5,2.5 μg/ml GO成骨誘導(dǎo)液對細(xì)胞培養(yǎng)。14 d后終止培養(yǎng),Trizol裂解、提取細(xì)胞總RNA并測定濃度與純度,將所提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用熒光定量試劑盒對成骨標(biāo)志基因進(jìn)行定量,分別檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣蛋白(ostecalcin,OCN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表達(dá),求各組2-ΔΔCt值,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR目的基因引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GO對hPDLSCs形態(tài)的影響

加入不同濃度的GO完全培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h后,采用PBS清洗3次。鏡下觀察,除0 μg/ml組外,各濃度組均有GO顆粒的沉積,12.5,62.5 μg/ml GO培養(yǎng)基中GO顆粒較多,并與細(xì)胞緊緊黏附至皿底。0.1,0.5,2.5,12.5 μg/ml GO完全培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)立體飽滿,呈長梭形,輪廓清晰,與0 μg/ml組無明顯差異。62.5 μg/ml GO完全培養(yǎng)基中細(xì)胞折光度降低,立體感消失,呈現(xiàn)扁平并發(fā)生皺縮(見圖1)。

A.0 μg/ml GO組;B.0.1 μg/ml GO組;C.0.5 μg/ml GO組;D.2.5 μg/ml GO組;E.12.5 μg/ml GO組;F.62.5 μg/ml GO組圖1 不同濃度GO培養(yǎng)的hPDLSCs形態(tài)學(xué)觀察 (×50)Figure 1 Morphological observation of hPDLSCs cultured with different concentrations of GO (×50)

2.2 GO對hPDLSCs增殖影響

加入不同濃度的GO完全培養(yǎng)基培養(yǎng),分別在1,3,5,7 d隨機(jī)取出一塊96孔板進(jìn)行CCK-8檢測。結(jié)果顯示:第1,3,5,7天,0.1,0.5,2.5,12.5 μg/ml GO對hPDLSCs增殖無影響,與0 μg/ml相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第1,3天,62.5 μg/ml GO對hPDLSCs增殖無影響(P>0.05),但從第5天起,62.5 μg/ml GO抑制hPDLSCs增殖,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖2,表2)。

與0 μg/ml比較，aP<0.001圖2 GO對hPDLSCs增殖影響Figure 2 The effect of GO on the proliferation of hPDLSCs

表2 CCK-8測定GO培養(yǎng)不同時(shí)間對hPDLSCs增殖影響

2.3 GO對hPDLSCs成骨能力的影響

2.3.1 茜素紅染色結(jié)果 不同濃度GO成骨誘導(dǎo)液對hPDLSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)14 d,進(jìn)行茜素紅染色。結(jié)果顯示,0 μg/ml GO組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量多、染色深、且形成的范圍較廣泛,隨著GO濃度的增大,礦化結(jié)節(jié)數(shù)量逐漸減少且范圍較小(見圖3)。

圖3 不同濃度GO培養(yǎng)hPDLSC茜素紅染色 (×50)Figure 3 Alizarin red staining of hPDLSC cultured with different concentrations of GO (×50)

2.3.2 成骨標(biāo)志基因表達(dá)結(jié)果 對hPDLSCs成骨誘導(dǎo)14 d,實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測成骨基因ALP、Runx2、OCN的表達(dá)。結(jié)果顯示,與0 μg/ml相比,ALP表達(dá)量隨著GO濃度的增高逐漸降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。在0.1,0.5 μg/ml GO成骨誘導(dǎo)液中的Runx2表達(dá)量下降(P<0.05),隨著GO濃度增高至2.5 μg/ml,Runx2表達(dá)量顯著下降(P<0.001)。OCN表達(dá)量在0.1,0.5 μg/ml GO成骨誘導(dǎo)液中與0 μg/ml相比無差異(P>0.05),在2.5 μg/ml GO成骨誘導(dǎo)液中明顯下降(P<0.001,見圖4)。

與0 μg/ml比較,*P<0.05,***P<0.001圖4 GO對hPDLSCs成骨基因表達(dá)的影響Figure 4 The effect of GO on the expression of hPDLSCs osteogenic genes

3 討論

石墨烯及其衍生物中,GO是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中有潛力的材料之一[10]。與其他材料相比,GO具有較大的表面積,易于被不同的官能團(tuán)修飾[11],在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大潛能,但GO表現(xiàn)出的毒性和生物安全性依舊需要引起重視[12,13]。

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞成骨分化方面探討不同濃度GO對hPDLSCs的影響。倒置顯微鏡觀察表明,0.1,0.5,2.5,12.5 μg/ml GO完全培養(yǎng)基中細(xì)胞形態(tài)飽滿,呈長梭形,輪廓清晰,與對照(0 μg/ml)無明顯差異;而62.5 μg/ml GO完全培養(yǎng)基中GO顆粒與細(xì)胞緊密黏附于皿底,細(xì)胞呈現(xiàn)扁平并發(fā)生皺縮,折光度降低,立體感消失。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高濃度GO對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)同樣有顯著影響,可使細(xì)胞伸展性下降,折光率降低。這些細(xì)胞形態(tài)的變化與氧化石墨烯的濃度呈正相關(guān)[14]。Olteanu等[3]通過激光共聚焦顯微鏡觀察也發(fā)現(xiàn)40 μg/ml GO導(dǎo)致人牙囊干細(xì)胞骨架收縮,微管結(jié)構(gòu)受損。由此可見,高濃度GO對細(xì)胞形態(tài)有顯著影響。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明,培養(yǎng)第1,3,5,7天,0.1,0.5,2.5,12.5 μg/ml GO對hPDLSCs增殖無影響(P>0.05),在第5,7天,62.5 μg/ml GO完全培養(yǎng)基抑制hPDLSCs增殖,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),GO對人成纖維細(xì)胞毒性表現(xiàn)為濃度依賴性,GO濃度小于20 μg/ml對細(xì)胞無影響,高于50 μg/ml表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性,并且可以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,降低細(xì)胞黏附[15]。Wu等[16]將人角膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)12.5-100 μg/ml GO培養(yǎng)基中,隨著時(shí)間跟濃度的增加,細(xì)胞活力降低,與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致。

本實(shí)驗(yàn)通過茜素紅染色與檢測成骨基因表達(dá)情況研究不同濃度GO對hPDLSCs成骨分化能力的影響。對hPDLSCs成骨誘導(dǎo)14 d后,茜素紅染色顯示,不同濃度GO成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)后,各濃度組均有礦化結(jié)節(jié)生成,0 μg/ml GO組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量多、染色較深,且形成的范圍較廣泛,隨著GO濃度的增大,礦化結(jié)節(jié)數(shù)量逐漸減少且范圍較小。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示,與0 μg/ml GO組相比,隨著GO濃度的增高,ALP、Runx2表達(dá)量逐漸降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001),OCN在2.5 μg/ml GO成骨誘導(dǎo)液組表達(dá)有顯著差異(P<0.001)。

關(guān)于GO對細(xì)胞增殖及成骨的影響,較為一致的觀點(diǎn)是高濃度GO存在細(xì)胞毒性[17]。但較低濃度GO對細(xì)胞增殖及成骨的影響,國內(nèi)外學(xué)者得出不同的結(jié)論。王潔等[13]發(fā)現(xiàn)低濃度GO對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖無促進(jìn)作用。魏常博等[7]發(fā)現(xiàn)GO濃度為0.1,0.5 μg/m以促進(jìn)人乳牙牙髓干細(xì)胞的黏附和增殖能力,并且可以促進(jìn)成骨相關(guān)蛋白表達(dá),這與我們的研究結(jié)果相反。其原因可能與GO有關(guān)。研究表明,在制備GO過程中,不同氧化時(shí)間和溫度、不同類型和濃度的氧化劑會(huì)極大地影響其結(jié)構(gòu)性能,進(jìn)而導(dǎo)致氧化水平不同、雜質(zhì)含量不同的GO作用于同一細(xì)胞系后會(huì)產(chǎn)生不同結(jié)果[18]。同時(shí),本實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞增殖與成骨誘導(dǎo)過程中,所設(shè)定的濃度梯度不適宜hPDLSCs的增殖及成骨分化,同時(shí)培養(yǎng)時(shí)間過長可能引起hPDLSCs成骨分化能力減弱。也可能是由于GO與細(xì)胞在培養(yǎng)皿中黏附,培養(yǎng)過程中多次換液造成GO富集,導(dǎo)致濃度改變。其具體抑制原因尚不清楚,還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確。

本研究將hPDLSCs與不同濃度GO培養(yǎng)基共培養(yǎng),結(jié)果表明隨著GO濃度增高和培養(yǎng)時(shí)間增加,hPDLSCs的增殖及成骨能力受到抑制,表現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性。在未來的研究中,如何使其更有利于干細(xì)胞的增殖與分化,更好地引導(dǎo)牙周組織再生,仍需要進(jìn)一步探究。