尚 娟,祝 瑞

(川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院,南充市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科,南充 637000;*通訊作者,E-mail:shangjuanzzyx@163.com)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是呼吸系統(tǒng)最常見的急危重癥之一,以肺組織過度炎癥反應和微循環(huán)通透性增加為主要特征,已經成為重癥醫(yī)學科患者死亡的主要原因之一[1]。ALI的病因多樣,發(fā)病機制復雜,但炎性反應失控在ALI發(fā)病過程中的作用已經得到公認[2]。目前臨床上對于ALI的治療以對癥支持治療為主,仍缺乏特異性藥物和有效的治療手段,死亡率仍居高不下[3]。因此探索能夠抑制ALI早期過度和失控炎癥反應的有效手段意義重大。

微小RNA(miRNAs)是由19-25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA,通過調控下游靶基因的表達發(fā)揮作用,參與調控機體細胞許多重要的生命活動[4]。近年來研究顯示miRNA在機體炎癥反應的調控中發(fā)揮著重要的作用,并且與ALI的發(fā)生進展密切相關[5]。研究發(fā)現miR-126是血管和心臟、肺等組織器官的內皮細胞中高表達的miRNA之一,參與多種免疫細胞的發(fā)育和功能的調控[6,7],在機體炎癥方面起著重要的作用[8-10]。Huang等[11]通過基因芯片技術發(fā)現包括miR-126在內的多個miRNA在ALI大鼠模型肺組織中表達降低,然而具體作用機制尚不清楚。因此,本研究通過體外構建膿毒癥ALI小鼠模型,探索miR-126對小鼠ALI肺損傷的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

清潔級C57BL/6小鼠40只,雄性,8-10周齡,體質量20-25 g,購自川北醫(yī)學院實驗動物中心。LPS購自美國Sigma公司;agomiR-NC、agomiR-126購自上海吉瑪公司;髓過氧化物酶(MPO)試劑盒購自南京建成公司;IL-1β、TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;PCR引物購自廣州銳博生物公司;HMGB1、GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2 小鼠分組及ALI模型建立

40只C57BL/6小鼠隨機分為control組、ALI組、ALI+agomiR-NC組和ALI+agomiR-126組,每組10只。ALI組利用腹腔注射LPS(5 mg/kg)誘導建立ALI模型[12,13],ALI+agomiR-NC組和ALI+agomiR-126組在建立ALI模型后即刻,分別從尾靜脈給予注射agomiR-NC和agomiR-126(80 mg/kg),control組僅以等量的生理鹽水進行腹腔和尾靜脈注射。本研究經實驗動物倫理委員會審查批準(批文號20190105),整個實驗過程嚴格遵循《實驗動物管理條例》規(guī)定。

1.3 觀察指標

1.3.1 血氣分析 ALI模型建立后24 h,用含肝素鈉注射器經頸動脈采血0.5 ml,在全自動血氣分析儀上行動脈動脈血氧分壓(PaO2)、二氧化碳分壓(PaCO2)和pH值的檢測。

1.3.2 支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度的檢測 ALI模型建立后24 h,頸椎脫臼法處死小鼠,開胸,結扎氣管和右側主支氣管,用1 ml注射器穿刺進入左側主支氣管應用0.3 ml PBS緩慢進行肺泡灌洗3次,收集BALF,4 ℃離心取上清液,應用IL-1β、TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度。

1.3.3 肺組織病理學觀察及肺損傷評分 取小鼠右肺上葉組織,4%多聚甲醛固定24 h后,石蠟包埋,行5 μm切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察肺組織的病理學變化,并參考文獻[14]的方法進行肺損傷病理評分。肺損傷病理評分依據肺泡出血、肺泡間隔水腫、肺泡內中性粒細胞浸潤、肺泡內纖維蛋白沉積4個方面進行評價,根據病變程度分別賦分:0分,正?；蛘咻p微病變;1分,輕度病變;2分,中度病變;3分,重度病變。

1.3.4 肺濕重/干重(W/D)比值的檢測 取右肺中葉及下葉組織100 mg,濾紙沾干表面水分,天平稱濕重后,放入80 ℃恒溫烘箱中烘烤48 h后,天平稱干重,計算W/D比值。

1.3.5 髓過氧化物酶(MPO)活性檢測 取右肺中葉及下葉組織100 mg,液氮研磨后,RIPA裂解液冰上裂解,收集裂解液,4 ℃離心取上清液,采用MPO檢測試劑盒測定MPO活性。

1.3.6 肺組織中miR-126表達的檢測 采用qRT-PCR測定肺組織miR-126的表達。取右肺中葉及下葉組織,應用Trizol提取肺組織總RNA,應用反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。參照qRT-PCR試劑盒說明書反應體系進行qPCR反應。miR-126引物正向:5′-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG-3′,反向:5′-CAUUAUUACUCACGGUACGAUU-3′;U6引物正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s,60 ℃,30 s,進行45個循環(huán)。以U6作為內參,miR-126的表達采用2-ΔΔCt法計算。

1.3.7 肺組織中HMGB1蛋白表達的檢測 采用Western blot法測定肺組織HMGB1蛋白的表達。取右肺中葉及下葉組織勻漿,加入RIPA裂解液提取蛋白并蛋白定量。取50 μg蛋白上樣,行10% SDS-PAGE電泳并轉移至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉3 h,加入抗HMGB1(1 ∶1 000)和GAPDH一抗(1 ∶2 000)4 ℃孵育過夜,次日再加入二抗室溫孵育1 h,經曝光顯影、照相,圖像分析軟件分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織miR-126、HMGB1蛋白表達水平的比較

與control組比較,ALI組小鼠肺組織miR-126相對表達明顯降低(P<0.05),HMGB1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺組織miR-126和HMGB1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺組織miR-126表達明顯升高(P<0.05),HMGB1蛋白表達明顯降低(P<0.05,見表1,圖1)。

表1 各組小鼠肺組織miR-126、HMGB1蛋白表達水平的比較

圖1 各組小鼠肺組織HMGB1蛋白表達Figure 1 Expression of HMGB1 protein in lung tissue of mice in each group

2.2 各組小鼠動脈血氣分析結果比較

與control組比較,ALI組小鼠動脈血pH值和PaO2明顯降低(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠動脈血pH值和PaO2差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠動脈血pH值和PaO2明顯升高(P<0.05)。各組小鼠動脈血PaCO2明顯差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表2)。

表2 各組小鼠血氣分析結果比較

2.3 各組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6濃度的比較

與control組比較,ALI組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯增多(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯減少(P<0.05,見表3)。

表3 各組小鼠BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的濃度的比較

2.4 各組小鼠肺組織病理學改變及肺損傷評分比較

control組小鼠肺泡形態(tài)規(guī)則,結構清晰完整。與control組比較,ALI組小鼠肺泡結構雜亂,肺泡壁增厚,肺泡腔內可見大量炎性細胞及紅細胞,肺損傷病理評分明顯升高(P<0.05,見圖2、表4);與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺組織病理學改變相近,肺損傷病理評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺組織病變學改變明顯減輕,肺損傷評分明顯降低(P<0.05,見圖2、表4)。

圖2 各組小鼠肺組織的病理學改變 (HE染色,×200)Figure 2 Pathological changes of lung tissue in mice in each group (HE staining,×200)

表4 各組小鼠肺組織損傷評分、W/D比值、MPO活性的比較

2.5 各組小鼠肺W/D比值、MPO活性的比較

與control組比較,ALI組小鼠肺W/D比值、MPO活性明顯升高(P<0.05)。與ALI組比較,ALI+agomiR-NC組小鼠肺W/D比值、MPO活性差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與ALI+agomiR-NC組比較,ALI+agomiR-126組小鼠肺W/D比值、MPO活性明顯降低(P<0.05,見表4)。

3 討論

膿毒癥是急性肺損傷發(fā)病的最常見原因之一,能夠直接或間接引起不同程度的肺損傷,嚴重者進展為ARDS,病死率可高達60%[15]。過度炎癥反應是膿毒癥誘發(fā)ALI的重要原因,但具體分子機制尚不清楚,如何有效控制ALI過程中過度炎癥反應,對于ALI的治療至關重要[16]。LPS是內毒素的主要成分,進入機體后快速誘發(fā)“炎癥風暴”,導致彌漫性肺損傷,腹腔注射LPS制備ALI動物模型是目前常用的理想方法[17,18]。本研究發(fā)現,ALI模型制備24 h后,小鼠動脈血pH值和PaO2明顯降低,BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯增多,肺組織出現ALI典型的病理學改變,肺損傷評分、W/D比值、MPO活性明顯升高,提示本研究制備ALI模型成功。

近年來研究顯示miRNA在ALI的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調控作用。Li等[19]在研究中發(fā)現miR-33低表達參與了LPS誘導的ALI的發(fā)病機制。過表達miR-146b可以有效地抑制LPS誘導的ALI小鼠的炎癥反應,減輕肺組織損傷[20]。miR-16通過調節(jié)TLR4/NF-κB通路和減輕炎癥反應,對小鼠ALI具有顯著的保護作用[21]。Wang等[22]發(fā)現miR-19缺陷的小鼠肺組織更容易受到炎癥反應的影響,恢復miR-19能夠減輕LPS誘導的ALI的炎癥反應。研究發(fā)現miR-126與機體多種疾病的炎癥及免疫反應有關[23,24],近期基因芯片技術發(fā)現包括miR-126在內的多個miRNA在ALI大鼠模型肺組織中表達降低[11],miR-126在ALI肺組織中表達降低是否與炎癥反應有關尚不清楚。本研究中我們通過qRT-PCR也發(fā)現ALI組小鼠肺組織miR-126表達明顯降低。進一步我們通過對ALI小鼠尾靜脈注射miR-126模擬物成功上調ALI小鼠肺組織中miR-126的表達,結果顯示,小鼠動脈血氣分析明顯改善,BALF中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量明顯減少,肺組織病理學改變明顯減輕,肺損傷評分、W/D比值、MPO活性明顯降低,提示上調miR-126能夠抑制ALI的炎癥反應,改善小鼠的肺組織損傷。

近期研究發(fā)現,miR-126能夠通過靶向調控HMGB1抑制高糖環(huán)境下內皮細胞[25]和視網膜細胞[26]的炎癥反應。本研究中我們也發(fā)現ALI小鼠肺組織中HMGB1蛋白的表達明顯升高。為了探索miR-126對ALI炎癥反應的抑制作用是否與其對HMGB1的調控有關,我們發(fā)現上調miR-126表達后,ALI小鼠肺組織HMGB1蛋白的表達明顯降低,提示上調miR-126對ALI小鼠肺組織的炎癥反應的抑制作用可能與其對HMGB1的調控有關。HMGB1是一種進化上高度保守的非組蛋白染色體結合蛋白,已經被證實在致死性的系統(tǒng)性炎癥反應中發(fā)揮著調節(jié)炎性介質的作用。HMGBl刺激促炎細胞因子的釋放,反之,促炎細胞因子也能促進HMGBl的釋放[27],形成了一個能夠放大炎癥反應的正反饋環(huán)。Abraham等[28]發(fā)現直接在小鼠氣管內注射HMGB1后會出現中性粒細胞聚集,肺水腫及IL-1β、TNF-α和MIP-2分泌的增加。研究發(fā)現,在內毒素引起的ALI中,HMGB1激活NF-κB轉錄引起的炎性因子水平的增加,導致肺血管滲透性的增加[29,30],從而引起ARDS。特異性阻斷HMGB1可明顯減輕LPS引起的損傷,Gong等[31]證實了HMGB1拮抗劑通過減少促炎因子的產生,對LPS導致的ALI小鼠有顯著保護作用。

綜上所述,miR-126在ALI小鼠肺組織中呈現異常低表達,上調miR-126能夠減輕ALI小鼠肺組織的炎癥反應,其機制可能與其對HMGB1的抑制有關,為ALI的治療提供了新的研究方向。