張瑜 吳才君 蘇文楨 周聰 滕麗姚 涂志偉 朱強龍

摘要：【目的】對西瓜OSCA基因家族進行成員鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析以及脅迫響應分析，為揭示西瓜OSCA基因生物學功能和抗逆分子機制提供參考依據(jù)。【方法】運用生物信息學的方法從西瓜全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出西瓜OSCA基因家族成員，根據(jù)染色體定位信息進行命名。對基因家族成員染色體位置、基因結構、共線性、啟動子、蛋白結構和系統(tǒng)發(fā)育等進行全面分析。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR分析西瓜OSCA基因在脅迫條件下的表達情況?！窘Y果】西瓜OSCA基因家族有10個成員，不均等地分布在6條染色體上。西瓜OSCA蛋白分子量變化范圍為24.59～91.97 kD，氨基酸數(shù)量為214～809 aa，多數(shù)定位于質(zhì)膜上。共線性分析結果表明，西瓜OSCA基因在進化過程中發(fā)生了片段復制事件。西瓜OSCA基因家族分為三大類群，同一類群成員的外顯子一內(nèi)含子的組成模式、蛋白保守基序排列、蛋白二級結構數(shù)量比例和蛋白三級結構模型均相似。西瓜、水稻、番茄和擬南芥的OSCA基因被分為6個亞族，每個亞族均有西瓜OSCA基因分布。西瓜OSCA基因啟動子區(qū)域含有厭氧誘導、冷脅迫應答、光反應和干旱脅迫應答等多種非生物脅迫響應元件。在干旱、低溫和鹽脅迫下，西瓜OSCA基因家族各成員表達量均有不同程度變化，其中ClaOSCA3和ClaOSCA5在3種不同脅迫條件下表達量均有顯著差異（P<0.05）?！窘Y論】西瓜OSCA基因在進化過程中具有一定保守性，與擬南芥、水稻和番茄OSCA基因存在較近親緣關系。西瓜OSCA基因家族內(nèi)部存在功能分化，ClaOSCA3和ClaOSCA5可能是脅迫響應機制中的重要抗逆基因。

關鍵詞： 西瓜;OSCA基因;脅迫響應;生物信息學

中圖分類號： S651? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）12-3330-10

Genome-wide identification and stress response analysis

of OSCA gene family in watermelon

ZHANG Yu， WU Cai-jun， SU Wen-zhen， ZHOU Cong， TENG Li-yao，

TU Zhi-wei， ZHU Qiang-long*

（College of Agronomy， Jiangxi Agricultural University， Nanchang? 330045， China）

Abstract：【Objective】The member identification， phylogenetic analysis and stress response analysis of watermelon OSCA gene family were carried out to provide reference for revealing the biological function and molecular mechanism of stress resistance of watermelon OSCA gene. 【Method】The members of watermelon OSCA gene family were identified by bioinformatics method from watermelon genome database， and named according to chromosome location information. Chromosome position， gene structure， collinearity， promoter， protein structure and phylogeny of gene family members were analyzed comprehensively. Transcriptome data and qRT-PCR were used to analyze OSCA gene expression in watermelon under stress. 【Result】Watermelon OSCA gene family had 10 members， which were unevenly distributed on 6 chromosomes. The molecular weight of watermelon OSCA protein varied from 24.59 to 91.97 kD， and the number of amino acids ranged from 214 to 809 aa， most of which were located in the plasma membrane. The results of collinearity analysis showed that the fragment replication event occurred during the evolution of watermelon OSCA gene. The watermelon OSCA gene family was divided into three groups， and the exon-intron composition pattern， conserved motif arrangement of protein， the number proportion of secondary structure and the tertiary structure model of the members of the same group were similar. The OSCA genes of watermelon， rice， tomato and Arabidopsis thaliana were divided into 6 subgroups， watermelon OSCA gene was distributed in each subgroup. The promoter region of OSCA gene in watermelon contained several abiotic stress response elements such as anaerobic induction， cold stress response， light response and drought stress response. Under drought， low temperature and salt stress， the expression levels of OSCA gene family members in watermelon all changed to different degrees， and the expression levels of ClaOSCA3 and ClaOSCA5 all changed significantly under three different stress conditions（P<0.05）. 【Conclusion】Watermelon OSCA gene is conserved in the evolutionary process， and is closely related to OSCA gene of A. thaliana， rice and tomato. Functional differentiation exists within the OSCA gene family in watermelon， and ClaOSCA3 and ClaOSCA5 may be important stress resistance genes in the stress response mechanism.

Key words： watermelon; OSCA gene; stress response; bioinformatics

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960607）

0 引言

【研究意義】植物OSCA是一種能感知細胞滲透勢變化的鈣離子非選擇性陽離子通道蛋白，在感受機制中調(diào)控信號轉(zhuǎn)導以應對自然界中各種不利環(huán)境條件（Zhu，2002;Bartels and Sunkar，2005）。西瓜[Citrullus lanatus（Thunb.） Matsum. et Nakai]是富含多種維生素的夏季水果，市場需求量不斷增加，抗逆育種研究是我國西瓜產(chǎn)業(yè)基礎研究的重要內(nèi)容（王超楠等，2018）。研究西瓜OSCA基因的功能及脅迫響應分子機制對培育優(yōu)良抗逆西瓜品種有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物在生長發(fā)育過程中，會受到自然界中許多不良環(huán)境因素的影響。其中干旱、低溫、高溫和鹽等非生物脅迫會使得植物難以維持正常的細胞結構和離子平衡。在嚴重的逆境脅迫情況下，植物的生理機制會受到嚴重破壞。在植物應對外界不良環(huán)境條件的保衛(wèi)機制中，作為第二信使的鈣離子會在鈣離子通道被激活后濃度快速升高，形成應激的鈣離子信號。鈣離子信號在下游轉(zhuǎn)移過程中調(diào)控植物細胞產(chǎn)生一系列的生理變化（李建偉等，2017），誘導出植物的抗逆性來應對外界的非生物脅迫（朱強龍等，2017），使得植物的生命系統(tǒng)繼續(xù)正常運轉(zhuǎn)。鈣信號的傳導與植物體中鈣離子通路蛋白密切相關，2014年鈣離子通道蛋白OSCA首次在模式植物擬南芥中被發(fā)掘報道（Yuan et al.，2014）。鈣離子通道蛋白在擬南芥中參與高滲脅迫響應（Batistic and Kudla，2012;Hou et al.，2014）。在前人對擬南芥OSCA基因家族進行的系統(tǒng)分析與鑒定中，基因家族分為4個亞族，15個家族成員均含DUF221功能結構域，在干旱或高鹽等高滲脅迫下，DUF221作為鈣離子依賴性通道的結構域發(fā)揮著重要作用。此外，OSCA基因被分別在水稻（Li et al.，2015）、梨（顧小雨，2017）等植物中鑒定和分析，驗證了OSCA基因在不同脅迫響應中的生物學功能?！颈狙芯壳腥朦c】目前為止，尚未見關于運用生物信息學手段對西瓜等葫蘆科植物OSCA基因進行分析的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】基于西瓜全基因組數(shù)據(jù)庫運用生物信息學的方法鑒定出OSCA基因家族成員，對西瓜OSCA基因的特征進行全面分析，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對西瓜OSCA基因在不同脅迫條件下的表達模式進行分析，篩選出重要抗逆基因并通過qRT-PCR對表達量進行檢測，為西瓜OSCA基因生物學功能研究提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗設計

以江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院保存的LSW-177西瓜品種為試驗材料，對四葉一心的LSW-177西瓜幼苗分別進行干旱（20% PEG6000）、低溫（4 ℃）和鹽（3 mmol/L KCl）脅迫處理。在處理后的0和6 h分別對西瓜幼苗的第2片真葉進行采樣，設置3次生物學重復，將樣品用液氮速凍后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1. 2 西瓜OSCA基因家族成員鑒定

在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫TAIR獲取擬南芥OSCA基因家族的氨基酸序列，并將其作為參考序列，與葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫（http：//cucurbitgenomics.org/）中的西瓜全基因組氨基酸序列進行比對（E-value小于1e-10，Identity大于60%）（朱強龍等，2017），篩選得到符合標準的西瓜OSCA家族候選基因。運用生信軟件TBtools中的Simple HMM Search功能輸出得到西瓜OSCA基因家族候選基因（Chen et al.，2020），與Blast分析結果進行比對后篩查矯正，利用PFAM（http：//pfam.xfam.org/）對候選基因進行預測分析，含完整DUF221結構域的候選基因為西瓜OSCA基因家族成員。利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析西瓜OSCA基因家族成員的蛋白序列，獲取蛋白理化信息，通過Softberry的ProtComp程序?qū)ξ鞴螼SCA蛋白進行亞細胞定位預測。

1. 3 染色體定位、共線性及選擇壓力分析

在西瓜基因組數(shù)據(jù)庫中獲取OSCA基因位置信息后使用MapGene2繪制染色體定位圖，利用TBtools對西瓜OSCA基因家族進行共線性分析，并計算重復基因?qū)χg非同義突變率與同義突變率的比值（Ka/Ks）（Wang et al.，2012），以此衡量環(huán)境選擇壓力，根據(jù)同義突變率估算重復基因?qū)Φ碾x散時間（Yuan et al.，2015），每年每個同義位點的替換量T=Ks/2X（X=6.56×10-9）。

1. 4 基因結構及蛋白保守基序分析

將已鑒定出的西瓜OSCA基因的核苷酸序列與編碼序列同時輸入到GSDS 2.0分析網(wǎng)站（http：//gsds.gao-lab.org/）（趙陽等，2015;Hu et al.，2015），利用MEGA 7.0內(nèi)置的ClustalW（Larkin et al.，2007）程序?qū)⒕幋a區(qū)的蛋白質(zhì)序列進行多重比對后（Kumar et al.，2016），采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建西瓜OSCA基因家族同源進化樹，重復運算1000次。整理圖形可獲取基因家族成員的內(nèi)含子與外顯子的分布情況，以及OSCA基因結構進化關系。通過MEME（https：//meme-suite.org/meme/）對西瓜OSCA基因家族成員蛋白基序類型和排列順序進行分析，Motif長度設置為6～50，查找Motif數(shù)量為20。

1. 5 蛋白跨膜結構、二級和三級結構分析

通過TMPred和TMHMM分析西瓜OSCA蛋白的跨膜區(qū)（雷召雄等，2019），使用SOPMA分析西瓜OSCA蛋白二級結構（趙鐘毓等，2020;趙訓超等，2021）;通過SWISS-MODEL（https：//www.swissmo-del.expasy.org/interactive）對西瓜OSCA蛋白三級結構的模型進行預測分析。

1. 6 OSCA基因系統(tǒng)進化和順式元件利用

在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）數(shù)據(jù)庫下載已報道的擬南芥、水稻和番茄的OSCA蛋白序列，并與西瓜OSCA蛋白序列進行多序列比對，構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（Bootstrap值設定為1000），使用ITOL在線網(wǎng)站（https：//itol.embl.de/）編輯美化進化樹。提取西瓜OSCA基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000 bp長度序列，利用PlantCare分析啟動子區(qū)域順式作用元件（Lescot et al.，2002）。

1. 7 基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的脅迫響應分析

從葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（PRJNA326331、PRJNA328189和PRJNA209092），以轉(zhuǎn)錄組分析通用的RPKM值作為基因表達量，分析西瓜OSCA基因家族各成員在干旱、低溫和鹽脅迫條件下的表達情況，篩選重要抗逆OSCA基因。

1. 8 重要抗逆基因的qRT-PCR檢測

使用Promega試劑盒提取樣品RNA，cDNA的合成采用TaKaRa試劑盒。利用Primer3 Plus設計特異性引物，選擇β-Actin基因為內(nèi)參（表1）。qRT-PCR反應體系20.0 μL：SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán);72 ℃ 5 min;熔解曲線65 ℃ to 95 ℃，溫度增量0.5 ℃ 0.05 s，終點讀板。

1. 9 統(tǒng)計分析

采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量，運用Excel 2013和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行整理分析。

2 結果與分析

2. 1 西瓜OSCA基因家族鑒定

運用生物信息學的方法鑒定出10個OSCA基因成員，根據(jù)染色體定位信息分別命名為ClaOSCA1～ ClaOSCA10。西瓜OSCA基因家族10個成員不均等地分布在6條染色體上，1號染色體（Chrom1）上4個，5號染色體（Chrom5）上2個。ClaOSCA9編碼氨基酸數(shù)量為214 aa，其余成員氨基酸數(shù)量范圍在714～809 aa。西瓜OSCA蛋白理化性質(zhì)的分析結果（表2）表明，蛋白分子量變化范圍為24.59～91.97 kD，ClaOSCA10的等電點（PI）最小，10個OSCA蛋白均為疏水的堿性蛋白，即親水系數(shù)（GRAVY）均大于0、PI均大于7.00。亞細胞定位結果表明，西瓜OSCA蛋白多數(shù)定位于質(zhì)膜。

2. 2 西瓜OSCA基因染色體分布及加倍事件分析

10個OSCA基因分布在1、2、5、8、9和10號染色體上（圖1），其余染色體上無OSCA基因。ClaOSCA5和ClaOSCA9在1號染色體上遺傳距離相對較近，ClaOSCA6和ClaOSCA8在5號染色體上遺傳距離相對較近。此外，西瓜OSCA基因在不同染色體組中分布不均等，表明OSCA基因在進化過程中可能發(fā)生了基因的復制或丟失。通過共線性分析發(fā)現(xiàn)，位于5號染色體的ClaOSCA6（Cla97C05G102470.1）與位于8號染色體（Chrom8）的ClaOSCA7（Cla97C08 G160460.1）存在片段重復事件（圖2），片段重復基因?qū)Φ腒s值為2.71719，分離時間在207Mya（Million years ago），Ka/Ks值為0.24741，小于1.00000，則說明西瓜OSCA基因在進化過程中受純化選擇作用。

2. 3 西瓜OSCA基因家族基因結構與蛋白保守基序分析

西瓜OSCA基因編碼氨基酸的多重序列比對結果（圖3）表明，在編碼序列中含有P、C、F等多個絕對保守位點，推測其在滲透脅迫下受到鈣離子滲透適應力作用。此外，對西瓜OSCA基因家族基因結構的分析結果（圖4）表明，10個ClaOSCA基因主要可分為三大類群，ClaOSCA1、ClaOSCA5、ClaOSCA2、ClaOSCA3、ClaOSCA4和ClaOSCA9這6個成員為同一類群，ClaOSCA7、ClaOSCA8和ClaOSCA6歸屬同一類群，ClaOSCA10單獨為一類群。此外，ClaOSCA7、ClaOSCA8和ClaOSCA6屬于同一類群，內(nèi)含子數(shù)目接近，外顯子與內(nèi)含子的組成模式相似，表明基因結構的保守性與基因進化關系是基本一致的。ClaOSCA10所在類群基因的長度較短且無內(nèi)含子，屬于內(nèi)含子缺失，結合進化樹來看ClaOSCA10基因在進化過程中可能存在一些非必要功能的丟失。

利用MEME在西瓜OSCA基因中預測到20個基序（圖5），基因同源性越高，基序排列相似性越強。10個OSCA基因均含有Motif13;除ClaOSCA10外其余9個基因均含Motif2;除ClaOSCA9和ClaOSCA10外其余8個ClaOSCA基因均含Motif1;ClaOSCA1、ClaOSCA2、ClaOSCA3、ClaOSCA4、ClaOSCA5和ClaOSCA9均含Motif3;ClaOSCA1、ClaOSCA5、Cla-OSCA2和ClaOSCA4具有相似基序且排列順序相同;ClaOSCA8、ClaOSCA6和ClaOSCA7屬于同源性較高的同一類群，具有相同基序且排列順序相同。

2. 4 西瓜OSCA基因家族蛋白跨膜結構、二級和三級結構分析

通過TMHMM與TMPred的分析結果發(fā)現(xiàn)，除ClaOSCA9蛋白相對分子質(zhì)量較小外，其余ClaOSCA蛋白均具有7～10個潛在的跨膜結構域（圖6），且西瓜OSCA蛋白均具有10種潛在的跨膜拓撲結構，表明西瓜OSCA蛋白均為膜蛋白，進化高度保守。西瓜OSCA基因家族蛋白二級結構分析結果（表3）表明，西瓜OSCA家族基因編碼10個蛋白的二級結構中主要是無規(guī)則卷曲結構和α螺旋結構，此外在西瓜OSCA蛋白二級結構中還有一小部分是β-轉(zhuǎn)角結構和延伸鏈結構;α螺旋結構數(shù)量比例為36.45%～54.62%，延伸鏈結構數(shù)量比例為12.00%～21.96%，β-轉(zhuǎn)角結構數(shù)量比例為1.51.%～7.01%，無規(guī)則卷曲結構數(shù)量比例為29.69%～36.58%。ClaOSCA6、ClaOSCA7和ClaOSCA8親緣關系較近，蛋白三級結構模型高度相似，ClaOSCA5和ClaOSCA1的蛋白三級結構模型高度相似（圖7）。

2. 5 西瓜OSCA基因家族系統(tǒng)進化分析和啟動子順式作用元件分析

西瓜、擬南芥、水稻和番茄的OSCA基因家族的系統(tǒng)進化分析結果（圖8）表明，OSCA基因進化樹主要分為6個亞族，分別命名I～Ⅵ。上述4種植物OSCA基因在6個亞族中均有分布，親緣性較近。西瓜OSCA基因家族中存在5個明顯的垂直同源基因?qū)?，分別是I亞族的ClaOSCA3與SlOSCA9，II亞族的ClaOSCA10與SIOSCA4，Ⅲ亞族的ClaOSCA6與SIOSCA1，Ⅳ亞族的ClaOSCA8與SlOSCA5，Ⅴ亞族的ClaOSCA2與AtOSCA8，以及Ⅵ亞族的ClaOSCA4與AtOSCA7、ClaOSCA1與SlOSCA8。西瓜OSCA基因家族中平行同源基因?qū)棰鰜喿宓腃laOSCA5和ClaOSCA9。Ⅳ亞族和Ⅵ亞族中OSCA基因數(shù)量較多，表明亞家族Ⅳ和Ⅵ中OSCA基因可能發(fā)生了功能分化。此外系統(tǒng)進化樹中亞家族I、II、Ⅲ和Ⅴ中OSCA基因數(shù)量較少，但這部分OSCA基因在進化中得以保留，說明在某些生物學過程中發(fā)揮關鍵作用。

順式作用元件對于旁側(cè)基因的功能調(diào)控具有重要作用，本研究提取西瓜OSCA基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游2000 bp的序列進行啟動子區(qū)域分析，發(fā)現(xiàn)存在多個與脅迫應答相關的順式作用元件（表4）。西瓜OSCA基因啟動子區(qū)域順式作用元件主要包括響應植物激素與非生物逆境脅迫的順式元件，其中，響應非生物脅迫的順式作用元件主要包括厭氧誘導順式元件（ARE）、冷脅迫應答順式元件（LTR）、光反應順式元件（G-box）、干旱脅迫應答順式元件（MBS）及防衛(wèi)和逆境應答順式元件（TC-rich repeats）。西瓜OSCA基因家族中有9個OSCA基因含厭氧誘導順式元件ClaOSCA1、ClaOSCA4、ClaOSCA5、ClaOSCA6和ClaOSCA8含有涉及低溫誘導性的冷脅迫應答順式元件。ClaOSCA4、ClaOSCA5和ClaOSCA7含有順式元件，說明這3個成員與應激反應有關。

2. 6 西瓜OSCA基因家族基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的脅迫響應分析

利用下載的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)對西瓜OSCA基因家族的表達模式進行分析，結果（圖9）顯示，在干旱、低溫和鹽脅迫下，西瓜OSCA基因家族各成員表達量均有不同程度變化，表現(xiàn)出不同的表達模式。在20% PEG6000脅迫下處理6 h后，ClaOSCA6和ClaOSCA8表達量上調(diào)，此外ClaOSCA1、ClaOSCA3和ClaOSCA5表達量顯著下調(diào)（P<0.05，下同），而ClaOSCA4和ClaOSCA6表達量變化較?。▓D9-A），說明ClaOSCA4和ClaOSCA6表達一般不受干旱脅迫的影響。經(jīng)過4 ℃低溫脅迫條件誘導6 h后ClaOSCA7表達量上調(diào)（圖9-B），其他9個基因均下調(diào)表達，其中，ClaOSCA2、ClaOSCA3和ClaOSCA5表達量出現(xiàn)顯著下調(diào)。而在3 mmol/L KCl脅迫下處理6 h后ClaOSCA1、ClaOSCA3和ClaOSCA5表達量顯著上調(diào)，ClaOSCA4表達量基本不變，ClaOSCA7、ClaOSCA8和ClaOSCA10表達量下調(diào)（圖9-C）。綜合上述脅迫響應情況表明，西瓜OSCA基因家族內(nèi)部在進化過程中可能發(fā)生了功能分化。此外，對西瓜OSCA基因表達情況進行分析與篩選，發(fā)現(xiàn)親緣關系較近的ClaOSCA3和ClaOSCA5在3種不同脅迫條件下表達量變化明顯，脅迫響應結果與2.5中2個基因家族成員的啟動子順式作用元件分析相對應，由此推測ClaOSCA3和ClaOSCA5可能為重要抗逆OSCA基因。

2. 7 重要抗逆基因的表達分析

運用qRT-PCR技術對重要抗逆基因ClaOSCA3和ClaOSCA5進行相對表達量檢測，結果（表5）表明：經(jīng)過20% PEG6000脅迫條件誘導6 h后，ClaOSCA3和ClaOSCA5表達量顯著下調(diào);在4 ℃下處理6 h后ClaOSCA3和ClaOSCA5表達量顯著下調(diào);在經(jīng)過3 mmol/L KCl脅迫條件誘導6 h后ClaOSCA3和ClaOSCA5均響應強烈。上述結果與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析結果基本相符合，進一步驗證ClaOSCA3和ClaOSCA5在脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用。

3 討論

鈣離子在誘導植物抗逆性應對非生物逆境脅迫條件過程中發(fā)揮著重要作用，而鈣離子信號傳導與能感知細胞滲透勢變化的鈣離子通道蛋白OSCA密切相關，因此對西瓜OSCA基因家族的研究為西瓜遺傳改良提供了依據(jù)。本研究基于西瓜基因數(shù)據(jù)庫對OSCA基因家族進行了全面分析，運用生物信息學的方法鑒定出10個OSCA基因?；驈椭剖录蚣易逋卣褂绕渲匾?，對西瓜OSCA基因家族進行共線性分析的結果表明在基因家族中存在片段重復，推測片段復制事件發(fā)生在單雙子葉分化時期（200～205 Mya）之后。基于系統(tǒng)發(fā)育分析，西瓜OSCA基因家族被分為3個類群。從基因結構分析來看同一個類群的外顯子一內(nèi)含子組成模式相似，與大豆OSCA基因家族的研究報道（李建偉等，2017）一致，也表明保守的基因復制現(xiàn)象出現(xiàn)在同一類群的OSCA基因家族拓展中。根據(jù)蛋白結構分析發(fā)現(xiàn)，同一類群成員的蛋白二級結構數(shù)量比例和蛋白三級結構模型比較相似。此外，西瓜OSCA基因家族成員均含有完整的DUF221特征結構域，與前人對擬南芥（Yuan et al.，2014）和番茄（王傲雪等，2019）等植物OSCA基因家族保守結構域的研究報道相一致。OSCA蛋白此前在被認為是跨膜通道蛋白和早期脫水應激蛋白（Yuan et al.，2014），本研究中西瓜OSCA蛋白的亞細胞定位分析結果與蛋白跨膜結構域分析結果相符合，表明西瓜OSCA蛋白均為膜蛋白。綜上所述，西瓜OSCA基因在進化過程中具有一定保守性。

西瓜、水稻、番茄和擬南芥OSCA基因家族的系統(tǒng)進化樹顯示西瓜與番茄之間存在4個垂直同源基因?qū)?，表明西瓜OSCA基因與番茄OSCA基因的親緣關系相對更近。此外，在西瓜OSCA基因啟動子區(qū)域中發(fā)現(xiàn)了特異且與光反應有關的光反應順式作用調(diào)節(jié)元件，但目前沒有在其他植物中發(fā)現(xiàn)，需要進一步探究。前人研究表明，OSCA是一種高滲脅迫響應通道蛋白，且初步驗證了OSCA基因與植物的逆境調(diào)節(jié)相關（Yuan et al.，2014）。本研究發(fā)現(xiàn)ClaOSCA3的啟動子區(qū)域不含冷脅迫應答順式作用元件，然而ClaOSCA3表達量在低溫脅迫下變化明顯，由此可推測單一脅迫條件誘導下，其他順式元件也能起到關鍵調(diào)控作用，或者啟動子區(qū)域存在未被鑒定出的相關順式元件。ClaOSCA6和ClaOSCA7存在片段復制現(xiàn)象，這2個基因家族成員的啟動子區(qū)域包含不同的順式元件，兩者的表達模式也有差異，說明基因組復制的過程中也存在功能分化現(xiàn)象。ClaOSCA3和ClaOSCA5在干旱、低溫和鹽脅迫條件下響應強烈，由此推測ClaOSCA3和ClaOSCA5應答3種脅迫的反應通路中存在交互性。已有研究表明，逆境下植物體內(nèi)鈣信號會迅速增加，高滲脅迫感受蛋白ClaOSCA的應激反應特性需進一步研究，而目前鈣信號調(diào)控下的西瓜OSCA脅迫響應分子機制尚未被解析完整，仍需在今后的研究中進行驗證。

4 結論

西瓜OSCA基因在進化過程中具有一定保守性，與擬南芥、番茄和水稻OSCA基因存在較近親緣關系。西瓜OSCA基因家族內(nèi)部存在功能分化，ClaOSCA3和ClaOSCA5可能是脅迫響應機制中的重要抗逆基因。

參考文獻：

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（責任編輯 鄧慧靈）