王學(xué)昉,孟維釗,王叢叢,張云飛,田思泉*,高春霞,韓東燕,陳錦輝,吳建輝

(1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306; 2.國家遠洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306; 3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開發(fā)教育部重點實驗室，上海 201306; 4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開發(fā)重點實驗室，上海 201306; 5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測實驗站,上海 201306; 6.上?？萍拣^自然史研究中心,上海 200041; 7.上海市水生野生動植物保護研究中心,上海 200092)

河口是生態(tài)環(huán)境十分脆弱和敏感的水域，其對生物種群的繁衍、資源補充及保持生態(tài)平衡都具有十分重要的意義[1]。長江口是我國最大的河口，該區(qū)域餌料生物豐富，是多種海洋生物的良好棲息地、產(chǎn)卵場和洄游通道[2]。了解長江口地區(qū)的生物資源動態(tài)變化是保護其水域生態(tài)健康的前提，為更好地了解和保護該水域的生態(tài)系統(tǒng)，需要建立有效的水生生物監(jiān)測體系。

水生生物監(jiān)測調(diào)查，特別是漁業(yè)資源調(diào)查，按照是否依靠漁業(yè)活動獲取數(shù)據(jù)分為依賴于漁業(yè)的調(diào)查(Fishery-dependent Survey)和獨立于漁業(yè)的調(diào)查(Fishery-independent Survey)[3]。在當(dāng)前長江流域?qū)嵭虚L期禁漁的背景下，很難再獲取漁業(yè)數(shù)據(jù)或基于漁業(yè)的調(diào)查數(shù)據(jù)，因此需要發(fā)展多元的獨立監(jiān)測技術(shù)來健全傳統(tǒng)的資源監(jiān)測體系。

隨著分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，20世紀80年代環(huán)境DNA (Environmental DNA, eDNA) 技術(shù)孕育而生，逐漸成為一種新興的生物監(jiān)測技術(shù)。該技術(shù)最大的優(yōu)勢是環(huán)境友好，只需要從環(huán)境中采集水樣，就可以了解到環(huán)境中的生物信息，不會對監(jiān)測對象造成傷害，因此十分適合監(jiān)測瀕?；蛘湎∥锓N[4]；其次，單一的采樣方法常常不能全面地采集群落中的所有生物，如底拖網(wǎng)一般只對底層魚類的捕獲率較高[5]，而環(huán)境DNA技術(shù)可以同時監(jiān)測游泳動物、底棲生物甚至包括浮游動植物、細菌、真菌和病毒等[6]。

長江口水域僅魚類就有140多種，還有中華鱘(Acipensersinensis)、江豚(Neophocaenaphocaenoidesasiaeorientalis)、松江鱸(Trachidermusfasciatus)等珍稀水生生物，具有多種監(jiān)測需求[7]。本研究從環(huán)境DNA技術(shù)的原理、發(fā)展、限制條件等方面介入，結(jié)合長江口具體的監(jiān)測需求和環(huán)境特點，對該水域使用環(huán)境DNA技術(shù)進行監(jiān)測的潛力進行展望，以期為長江大保護工作提供更加豐富的參考信息。

1 環(huán)境DNA技術(shù)的監(jiān)測原理與發(fā)展

環(huán)境DNA是生物體擴散于環(huán)境中的DNA，來源可以是脫落的細胞和組織，也可以是排泄物或粘液[8]。環(huán)境DNA技術(shù)是在確定調(diào)查物種或種群的特異性基因識別片段的基礎(chǔ)上，檢測從環(huán)境介質(zhì)中提取環(huán)境DNA的種類與數(shù)量，進而確定取樣環(huán)境中生物的種類與數(shù)量，以達到監(jiān)測目標(biāo)物種的目的的技術(shù)[9]。

環(huán)境DNA技術(shù)起源于微生物領(lǐng)域，最早被用于分離純化環(huán)境中微生物的DNA[10]，隨后逐漸被應(yīng)用于植物群落多樣性等領(lǐng)域[11]，主要用于測定空氣中的植物孢子，后來才被用于監(jiān)測水生動物。Ficetola等(2008)最先將環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用于淡水入侵物種的監(jiān)測[12]；Thomsen等(2012)首次使用環(huán)境DNA技術(shù)分析海洋中的生物多樣性，擴大了環(huán)境DNA技術(shù)的應(yīng)用水域[13-14]。從2008年至今，環(huán)境DNA技術(shù)經(jīng)歷了由監(jiān)測單一物種到多個物種，再到調(diào)查生物多樣性的歷程，目前已發(fā)展到可評估部分物種的資源量；其適用水體也從流動性較小的封閉淡水水體(如池塘、湖泊)，擴展至開放水體(如溪流、河流)，最終應(yīng)用于鹽水、半鹽水水域(如河口、近海)；監(jiān)測對象由小型底棲動物發(fā)展到兩棲動物、魚類、哺乳動物甚至是水禽。

2 環(huán)境DNA技術(shù)在水生生物監(jiān)測中的應(yīng)用

目前，環(huán)境DNA技術(shù)在水生生物監(jiān)測中主要使用在四個方面，一是監(jiān)測特定物種，如瀕危物種和入侵物種；二是調(diào)查生物多樣性；三是評估資源量；四是監(jiān)測物種的遺傳多樣性。前兩方面的技術(shù)發(fā)展較為成熟，因此應(yīng)用也較多，而在對于資源量的評估與遺傳多樣性的監(jiān)測方面仍處于探索階段。

2.1 特定物種

2.1.1 珍稀物種和瀕危物種 珍稀動物和瀕危物種在自然界的密度很低，利用常規(guī)性的調(diào)查監(jiān)測它們的存在具有固有的困難。對于淡水生態(tài)系統(tǒng)的低密度目標(biāo)物種，已可通過環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測其存在與否[10]。這是因為生物的環(huán)境DNA通過在水體中的快速擴散，可以在一定范圍內(nèi)的任意地點被檢測到[4]；環(huán)境DNA技術(shù)還能監(jiān)測到任何生活史階段的目標(biāo)物種[15]，極大地避免了調(diào)查網(wǎng)具網(wǎng)目尺寸選擇性的約束；環(huán)境DNA技術(shù)還是一種環(huán)境友好型的監(jiān)測方法，監(jiān)測過程本身不會對目標(biāo)物種和棲息地造成物理傷害，這對于珍稀瀕危物種及脆弱的生境而言相當(dāng)重要。

目前，環(huán)境DNA技術(shù)已成功應(yīng)用于河口、河流及池塘的珍稀或瀕危的魚類[15]、兩棲類[16]、水生哺乳動物[17]的監(jiān)測，表現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。在長江流域，Ma等(2016)設(shè)計出適合長江江豚的特異性引物，使用環(huán)境DNA技術(shù)對長江江豚進行了調(diào)查[17]；Stewart等(2017)通過環(huán)境DNA的信息推測出長江江豚種群的時空分布[18]；Qu等(2019)在以長江江豚為對象的監(jiān)測中，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR， qPCR)較傳統(tǒng)視覺觀察與捕獲相比，其覆蓋面積更廣，且成本更低[19]；徐念等(2018)使用該技術(shù)對中華鱘的生殖洄游路線進行了分析，并認為其結(jié)果很好的反映了中華鱘的季節(jié)性洄游模式[20]；吳昀晟等(2019)對江蘇江段的長江江豚分布進行了調(diào)查，并與傳統(tǒng)方法比較后發(fā)現(xiàn)，8個使用傳統(tǒng)方法觀測到江豚的站點均檢測到了江豚的DNA，10個疑似站點中3個檢測到了江豚的DNA[21]。這些研究都表明在長江流域使用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測珍稀物種活動的可行性。

2.1.2 入侵物種 入侵物種是指對經(jīng)濟生產(chǎn)、生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性、人類健康等帶來威脅的外來物種[22]。生物入侵是導(dǎo)致生物多樣性喪失的重要原因之一[23]。環(huán)境DNA技術(shù)能夠應(yīng)用于入侵物種的監(jiān)測，特別是在外來物種入侵的早期階段，其種群密度比較低，往往并不引人注意，但此時也是最佳防控時機，如果失控將導(dǎo)致防除成本急劇增加，甚至難以根除。因此，在外來種入侵或擴散初期施行有效監(jiān)測、預(yù)警至關(guān)重要，而環(huán)境DNA技術(shù)在這一階段較傳統(tǒng)監(jiān)測方法具有更為明顯的優(yōu)勢。

目前，使用環(huán)境DNA技術(shù)在監(jiān)測入侵物種方面已有多個成功案例，如Ficetola等(2008)發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA技術(shù)不僅能在所有傳統(tǒng)方法奏效的水體中監(jiān)測到美國牛蛙(Ranacatesbeiana)，還能在一些傳統(tǒng)方法失敗的地點進行成功監(jiān)測[12]；Jerde等(2011)將環(huán)境DNA技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)漁業(yè)資源調(diào)查監(jiān)控勞倫斯河流域的入侵物種，發(fā)現(xiàn)真實的威脅程度遠高于傳統(tǒng)方法的估計[24]。目前監(jiān)測水生入侵物種時常使用的方式是走訪調(diào)查和傳統(tǒng)網(wǎng)具捕撈相結(jié)合[25]，偶爾會使用遙感技術(shù)研究入侵物種的分布狀況[26]，這幾種監(jiān)測方式在入侵早期的敏感性較低，且成本較高[27]。長江口水域是國際航線的交通要塞，遠洋船舶的壓艙水是造成生物入侵的重要途徑[28]。目前，國內(nèi)對壓艙水內(nèi)入侵物種的鑒定方法主要是采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合分子生物學(xué)的方法[29]，而美國研究人員已經(jīng)將環(huán)境DNA技術(shù)應(yīng)用于壓艙水的檢測[30]。

2.2 生物多樣性

生物多樣性具有極高的價值，物種的過度缺失會造成生態(tài)失衡[31-32]。生物多樣性涉及遺傳多樣性、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性3個層次[33]，環(huán)境DNA技術(shù)在物種多樣性的監(jiān)測上也具有適用性。Thomsen等(2012)利用環(huán)境DNA信息發(fā)現(xiàn)能在封閉的實驗生態(tài)系統(tǒng)中檢測到兩棲類和所有魚類，相比之下，開放的海洋環(huán)境中可能由于洋流和鹽度等環(huán)境因素的影響，環(huán)境DNA技術(shù)只能檢測出部分物種，但相比于潛水、底拖網(wǎng)、籠壺等傳統(tǒng)調(diào)查方法，其監(jiān)測效率明顯更高[14]。然而，F(xiàn)oote等(2012)使用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測開闊水域的生物群落時，發(fā)現(xiàn)其對于領(lǐng)航鯨(Globicephalamelas)的靈敏性就低于傳統(tǒng)聲學(xué)調(diào)查技術(shù)，這可能是由于海水中的環(huán)境DNA被稀釋后密度過低所致[34]。在長江流域，徐念等(2016)在宜昌至南京江段的對比調(diào)查表明，漁獲物調(diào)查最少采樣到17種魚類，而利用環(huán)境DNA只檢測出15種魚類，但是含有網(wǎng)具沒有捕獲的種類[35]；Zhang等(2019)使用該技術(shù)調(diào)查了長江口區(qū)域不同季節(jié)的魚類組成，共鑒定出41個種類，雖然鑒定出的種類數(shù)量較多，但是缺乏與網(wǎng)具采樣效果的對比[36]。這些研究說明環(huán)境DNA技術(shù)的監(jiān)測效果在不同類型的水體中有所差別，在一些水域能夠較好地代替?zhèn)鹘y(tǒng)的調(diào)查方法，而在另一些水域只能作為補充手段，這可能與這些水體的環(huán)境特征有關(guān)，其適用性需要針對具體的調(diào)查水域進行進一步的評估。

2.3 資源量調(diào)查

對目標(biāo)生物的資源豐度進行調(diào)查是水生生物資源監(jiān)測的重要內(nèi)容，傳統(tǒng)上依賴網(wǎng)具和聲學(xué)手段進行。Ficetola等發(fā)現(xiàn)了牛蛙密度高的池塘中所提取的DNA擴增率明顯高于低密度的池塘，這為使用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測資源豐度提供了啟示[12]。近十幾年來，不斷有學(xué)者嘗試利用環(huán)境DNA技術(shù)在不同水域?qū)Χ喾N生物進行調(diào)查研究[37-38]。這些研究結(jié)果表明動物密度與其環(huán)境DNA濃度之間存在某種非線性關(guān)系，可以通過測量一個樣本中環(huán)境DNA拷貝的數(shù)量來估算物種生物量[39]。常見的方法為在實驗室條件下飼養(yǎng)目標(biāo)物種，再檢測水樣中的環(huán)境DNA濃度，由此繪制種群密度與環(huán)境DNA濃度關(guān)系的標(biāo)準曲線，在此基礎(chǔ)上采集監(jiān)測水域中的水樣并測量環(huán)境DNA濃度，通過對比標(biāo)準曲線就可推算監(jiān)測物種的密度和分布[40]。然而，這種方法只適合于水樣中環(huán)境DNA濃度與該物種數(shù)量的相關(guān)性較強的物種，對于帶有堅硬外殼的蝦類或者貝類的物種，其環(huán)境DNA濃度與生物量之間的關(guān)系并不明顯[41-42]。

由于技術(shù)等諸多因素的限制，單獨依靠環(huán)境DNA技術(shù)對資源量進行調(diào)查仍有較大不確定性，相關(guān)技術(shù)的改進一直處于探索之中，Doi等(2015)發(fā)現(xiàn)微滴式數(shù)字PCR (Droplet Digital PCR, ddPCR)比qPCR更適合于測定水中環(huán)境DNA的濃度[43]；Takahala等(2012)嘗試了使用不同孔徑的濾膜來進行檢測，并對比出了更適合當(dāng)?shù)仵庺~(Cyprinuscarpio)的濾膜孔徑，并成功使用環(huán)境DNA技術(shù)對當(dāng)?shù)氐孽庺~群落進行了監(jiān)測[44]；盧珊等(2015)發(fā)現(xiàn)酒精多次沉淀法濃縮的水樣可獲得最佳的環(huán)境DNA提取效果[45]。目前，環(huán)境DNA技術(shù)常配合其他方法共同調(diào)查資源量，如在Sigsgaard等(2015)的研究中，將環(huán)境DNA技術(shù)結(jié)合潛水員觀察，發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA技術(shù)的結(jié)果與潛水觀測的結(jié)果呈現(xiàn)高度一致性[37]。在長江流域，吳昀晟等(2019)使用該技術(shù)通過多項式估算了長江江蘇段的江豚數(shù)量，但估算缺乏與實際觀測數(shù)量的對比驗證[21]。除了江豚以外，在長江流域還未有更多的利用環(huán)境DNA技術(shù)調(diào)查物種豐度的報道出現(xiàn)，因此該應(yīng)用方向也具有廣闊的探索空間。

2.4 遺傳多樣性

遺傳多樣性一般所指的是種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)個體之間或一個群體內(nèi)不同個體的遺傳變異總和。使用環(huán)境DNA技術(shù)分析遺傳多樣性的原理是檢測樣品中同一種群中每個個體之間的DNA差異來分析其遺傳變異。Sigsgaard等(2016)使用環(huán)境DNA技術(shù)對阿拉伯海灣鯨鯊(Rhincodontypus)的遺傳多樣性進行了分析，得到了其種群數(shù)量及結(jié)構(gòu)[46]；Tsuji等(2020)使用該技術(shù)發(fā)現(xiàn)能從低濃度且含有外來物質(zhì)的樣本中識別出香魚(Plecoglossusaltivelis)個體的差異，雖與傳統(tǒng)捕獲方法相比能明顯檢測到更多個體，但是也沒有覆蓋該種群的全部遺傳多樣性[47]。因此，盡管基于環(huán)境DNA的方法仍有一定的局限性和誤判風(fēng)險，但具備作為調(diào)查野外物種遺傳多樣性有效方法的潛力。

3 影響因素與局限性

3.1 自然因素

根據(jù)目前的研究，對環(huán)境DNA降解的速率影響較大的環(huán)境因子有pH值、溫度、光照、流速、水深等。Seymour等(2018)發(fā)現(xiàn)，一般情況下酸性環(huán)境加快了環(huán)境DNA的降解速度，環(huán)境DNA在堿性和中性條件下的降解速度幾乎沒有差異[48]；另外，高溫也被認為會加速環(huán)境DNA的降解，且光照常與高溫相伴隨，因此也常被認為會加速環(huán)境DNA的降解，但也有特殊情況，如Andruszkiewicz等(2017)發(fā)現(xiàn)溫度對日本鯖(Scomberjaponicus)的環(huán)境DNA降解幾乎沒有影響，光照也不是導(dǎo)致其環(huán)境DNA衰退的主要原因[49]。

雖然近年來科學(xué)界對于環(huán)境因子影響環(huán)境DNA鑒定結(jié)果準確性的研究在不斷進行，但是由于對影響環(huán)境DNA的物理和化學(xué)因素，以及對環(huán)境DNA降解和轉(zhuǎn)運過程的了解仍然有限，因此還是很難獲知監(jiān)測對象存在的精確時間、距離和數(shù)量。

3.2 外界污染

環(huán)境DNA樣品在每一個操作過程中都可能發(fā)生污染，即混入來自非目標(biāo)水樣的DNA。由于環(huán)境DNA技術(shù)的靈敏性，少許的污染就會對最終的結(jié)果造成巨大的誤差。因此在調(diào)查前必須采取嚴格的控制措施，包括對采樣工具、設(shè)備進行滅菌處理[37]；在操作過程中始終佩戴一次性無菌手套并及時更換[13]；每個采樣點增加陰性對照組，即過濾蒸餾水或無目標(biāo)生物生存區(qū)域的水樣，也有助于驗證實驗過程中有無污染[24]；每個采樣點的樣品隔離保存，防止交叉污染。

3.3 技術(shù)因素

環(huán)境DNA的操作流程分為環(huán)境DNA的獲取、提取和鑒定等步驟[50]，其中最常影響結(jié)果的環(huán)節(jié)就是環(huán)境DNA的鑒定。這是因為在環(huán)境DNA的鑒定過程中，目前常用到的PCR技術(shù)具有偏向性，因此PCR結(jié)果的DNA比例并不一定等同于被監(jiān)測生物群體的比例[51]，從而造成誤差。為解決PCR技術(shù)帶來的誤差，可以在測序時使用單分子測序技術(shù)[52]，該技術(shù)不需要使用PCR擴增，可以解決目前測序中所存在的偏向性問題。另一方面，在環(huán)境DNA的鑒定過程中，常使用到DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)，但由于其分辨率較低，有時無法區(qū)分檢索序列匹配程度相同的物種[53]，因此，相同的序列可能代表不同的物種，Wilcox等(2013)通過對美洲紅點鮭(Salvelinusfontinalis)和強壯結(jié)點鮭(S.confluentus)的檢測，發(fā)現(xiàn)在基因型相似的情況下，種間特異性不足可導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果[54]。徐念等對長江中下游干流環(huán)境DNA樣本進行監(jiān)測時，魚類物種中的鯉及其部分亞種分別與檢索序列匹配程度相同而導(dǎo)致無法區(qū)分[35]。

4 環(huán)境DNA技術(shù)在長江口水生生物監(jiān)測中應(yīng)用的建議

長江口水域的水生生物資源監(jiān)測中根據(jù)項目目標(biāo)的不同具有多種的監(jiān)測需求。在監(jiān)測特定物種方面，除了江豚和中華鱘，長江口水域還棲息著松江鱸、花鰻鱺(Anguillamarmorata)、胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)等諸多珍稀瀕危物種[55]，它們數(shù)量稀少，或在洄游過程中季節(jié)性地出現(xiàn)在河口水域[56-59]，因此在長江口的重點水域開展常規(guī)性的環(huán)境DNA調(diào)查，以監(jiān)測珍稀瀕危物種的出現(xiàn)和分布，可能具有極大的應(yīng)用潛力。在監(jiān)測珍稀物種時，也可以同時監(jiān)測其遺傳多樣性，分析其種群結(jié)構(gòu)與個體狀態(tài)，從而有利于更好地對其制定保護措施。另外，上海作為遠洋船舶密集分布的國際航運中心，對于水體中外來種或入侵種擴散趨勢的監(jiān)測具有強烈需求，因此環(huán)境DNA技術(shù)還可以成為長江口水域生態(tài)安全監(jiān)測體系的重要組成部分。

長江口生物多樣性的監(jiān)測一直是該區(qū)域監(jiān)測工作的重點，漁獲物分析作為傳統(tǒng)監(jiān)測體系的重要信息源[60]，可以預(yù)見在長江流域長期禁漁的背景下將會受到限制，增加環(huán)境DNA技術(shù)可能有助于補充監(jiān)測手段和信息來源，構(gòu)建更加多元的監(jiān)測體系。但是，長江口區(qū)域的地形、水文條件復(fù)雜多變，環(huán)境DNA技術(shù)與傳統(tǒng)方法的監(jiān)測效果的優(yōu)劣需要進行比較研究。譬如，長江口沿岸碎波帶是諸多暖水性魚類仔稚魚的保育場，因此是生物多樣性監(jiān)測的重點區(qū)域，但碎波帶區(qū)域大多地勢低平，部分岸段灘窄坡陡，底質(zhì)由泥沙堆積而成，結(jié)構(gòu)松散，易受侵蝕，導(dǎo)致其水流中泥沙含量較高，在過濾時會阻塞濾膜孔，從而可能影響環(huán)境DNA結(jié)果的準確性[61-63]，可以使用多層紗布進行預(yù)過濾以防止濾膜阻塞，提高檢出率[21]。

在經(jīng)濟魚類資源量調(diào)查方面，長江口水域作為我國重要的傳統(tǒng)漁場，是多種經(jīng)濟魚種如刀鱭(Coilianasus)[64]、鳳鱭(Coiliamystus)[65]和棘頭梅童魚(Collichthyslucidus)[66]的良好索餌場，相關(guān)資源量的波動是常規(guī)性的監(jiān)測內(nèi)容，雖然目前在長江流域應(yīng)用環(huán)境DNA技術(shù)進行生物量監(jiān)測的案例很少，但是特定物種環(huán)境DNA濃度在時間尺度上的相對變化是一個值得嘗試的研究內(nèi)容和應(yīng)用探索。另外，對于魚卵與仔稚魚的資源補充量監(jiān)測，都存在使用環(huán)境DNA技術(shù)補充傳統(tǒng)調(diào)查手段的應(yīng)用潛力。