方 超，張智明，李建華，何世岷

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

豬流行性感冒簡(jiǎn)稱(chēng)豬流感（Swine influenza，SI），是由A 型流感病毒引起的一種豬的急性呼吸道傳染病，主要臨床癥狀為咳嗽、打噴嚏、發(fā)熱、趴臥、食欲減退等[1-4]。豬流感的發(fā)病率極高，且傳染性強(qiáng)，很難切斷傳播途徑，一旦感染在短時(shí)間內(nèi)可波及全群，對(duì)豬的生長(zhǎng)性能造成不良的影響。單純感染豬流感時(shí)死亡率并不高，但若與其他病原混合感染會(huì)使死亡率驟增，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-8]。豬流感病毒的流行存在地域性，易發(fā)生變異，且具有數(shù)十種亞型。豬流感的流行特點(diǎn)導(dǎo)致免疫接種是目前防控該病的唯一有效手段，因此從發(fā)病現(xiàn)地分離病毒并制備疫苗對(duì)該病的防控尤為重要[9-10]。

1 材 料

疑似豬流感發(fā)病豬的鼻拭子樣品8份，某豬場(chǎng)現(xiàn)地采集；HI 效價(jià)為1∶640 的豬流感病毒H1 亞型特異性陽(yáng)性血清，HI 效價(jià)為1∶640 的豬流感病毒H3 亞型特異性陽(yáng)性血清，HI 效價(jià)為1∶320 的豬流感病毒H5 亞型特異性陽(yáng)性血清，HI 效價(jià)為1∶320的豬流感病毒H9 亞型特異性陽(yáng)性血清，豬流感病毒H1N1亞型HA和NA基因陽(yáng)性質(zhì)粒，豬流感病毒H3N2 亞型HA 和NA基因陽(yáng)性質(zhì)粒，均由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；病毒基因組DNA/RNA 快速提取試劑盒，購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司；DL-2000 DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；豬流感H1、H3、N1 和N2 的分型鑒定引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；1%雞紅細(xì)胞懸液，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司質(zhì)量管理部參照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》制備保存；PBS 溶液，由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司研發(fā)中心配制保存；SPF雞胚，購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；4～6周齡健康易感的陰性仔豬10頭，購(gòu)自哈爾濱市郊某豬場(chǎng)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方 法

2.1 病料的處理

取出采集到的鼻拭子樣品，充分振蕩后分別取出鼻拭子中的液體置于無(wú)菌離心管中，標(biāo)明序號(hào)，隨后將樣品經(jīng)8 000 r·min-1離心10 min，取上清液保存于-70 ℃冰箱中，備用。

2.2 病毒的分離

將處理好的上清液無(wú)菌接種于10～11 日齡SPF雞胚的尿囊腔，每個(gè)樣品接種5枚雞胚，每枚雞胚接種0.2 mL，接種后將雞胚的接種孔封蠟并置于35 ℃、濕度為60%～65%的孵化箱中培養(yǎng)，每隔12 h檢胚1次，24 h內(nèi)死亡的雞胚直接棄去，24 h后死亡的雞胚逐一收獲，培養(yǎng)72 h 取出全部雞胚置于2～8 ℃冷卻12 h以上，分別無(wú)菌收獲雞胚尿囊液并留樣進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。檢出陽(yáng)性樣品，置于-70 ℃冰柜保存?zhèn)溆?，盲? 代仍為陰性的樣品視為陰性，直接棄去（凝集價(jià)＜1∶16 判為陰性，凝集價(jià)≥1∶16判為陽(yáng)性）。

2.3 半數(shù)雞胚感染量（EID50）的測(cè)定

用PBS 液將分離獲得的病毒液作10 倍系列稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-6、10-74 個(gè)稀釋度，分別經(jīng)尿囊腔接種10～11日齡SPF雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，每枚雞胚接種0.1 mL，置35 ℃、濕度為60%～65%的孵化箱中孵育觀察72 h，逐個(gè)收獲雞胚的尿囊液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)≥1∶16者判為感染，使用Reed-Muench法計(jì)算EID50。

2.4 病毒的鑒定

2.4.1 血清學(xué)鑒定

取檢測(cè)為陽(yáng)性的樣品按照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》中方法配制4 HAU 抗原，分別與豬流感病毒H1、H3、H5、H9亞型特異性陽(yáng)性血清中和，通過(guò)紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)進(jìn)行血清學(xué)鑒定。

2.4.2 分子生物學(xué)鑒定

取陽(yáng)性樣品，按劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA。取10 μL RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL：依次加入 Radom Primer 1 μL，模板 RNA 10 μL，72 ℃5 min后冰浴5 min，再加入5×反轉(zhuǎn)錄酶Buffer 4 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、RNA 酶抑制劑 0.5 μL、M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶1 μL、dd H2O 1.5 μL，然后置于96 ℃5 min，37 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h，用于PCR反應(yīng)。

用豬流感病毒H1、H3、N1、N2 亞型分型鑒定引物進(jìn)行PCR 鑒定，所擴(kuò)增片段大小依次為320 bp、750 bp、738 bp 和 498 bp[11]。PCR 擴(kuò)增體系為 25 μL：依次加入 10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA 1.0 μL，Taq酶0.5 μL，滅菌去離子水17.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，H1 型 53 ℃、H3 型 53.5 ℃、N1 型 52.5 ℃、N2 型 53 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃終止循環(huán)。將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳并與DL-2000 DNA Marker進(jìn)行比較，得出試驗(yàn)結(jié)果。

2.5 病毒的純化與鑒定

按照2.3 中方法，用PBS 液稀釋分離到的病毒液，取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-65 個(gè)稀釋度接種SPF 雞胚，每個(gè)稀釋度接種5 枚雞胚，每次僅收獲陽(yáng)性樣品中最高稀釋度的單胚尿囊液用于傳代，連續(xù)純化3 代后的病毒液作為F0 代，進(jìn)行擴(kuò)繁F1代。純化后的病毒按照2.4.1、2.4.2 中的方法進(jìn)行血清學(xué)及分子生物學(xué)鑒定。

2.6 病毒的電鏡鑒定

將純化后的病毒樣品送至哈爾濱獸醫(yī)研究所電鏡室，進(jìn)行電鏡鑒定。

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

從哈爾濱市郊購(gòu)買(mǎi)4～6周齡健康易感的陰性仔豬10 頭，隨機(jī)選取5 頭，分別經(jīng)氣管接種病毒含量≥106.0EID50·0.1 mL-1的純化后的分離株病毒液4.0 mL，其余5頭相同條件下飼養(yǎng)作為對(duì)照。攻毒后1～5 d連續(xù)測(cè)溫，并觀察記錄豬流感特異性臨床癥狀；攻毒后1～3 d，每天分別采集每頭豬的鼻拭子并標(biāo)記好耳號(hào)，參照2.2中方法對(duì)30份鼻拭子樣品進(jìn)行病毒分離，每份樣品接種的雞胚中有1枚雞胚液紅細(xì)胞凝集價(jià)≥1∶16，即判為病毒分離陽(yáng)性。分離陰性的樣品，應(yīng)盲傳1代，如仍為陰性，即判為病毒分離陰性；攻毒后5 d，對(duì)所有仔豬進(jìn)行大體剖檢，并觀察肺部病變。

3 結(jié)果與分析

3.1 病毒的分離

按照2.2 中方法操作，其中1 份病料接種的雞胚盲傳2 代時(shí)收獲的雞胚尿囊液出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，效價(jià)為1∶128，通過(guò)有限稀釋法接種10～11 日齡雞胚檢測(cè) EID50為10-5.32EID50·0.1 mL-1，結(jié)果見(jiàn)表1。病毒分離的胚體病理變化結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可見(jiàn)，接種后雞胚的胚體出現(xiàn)水腫、出血等病理變化。

表1 病毒EID50測(cè)定結(jié)果

圖1 豬流感病毒分離的胚體病理變化

3.2 病毒的鑒定

3.2.1 血清學(xué)鑒定

將分離獲得的病毒進(jìn)行血清學(xué)鑒定，可見(jiàn)病毒僅對(duì)豬流感病毒H3 亞型特異性抗血清發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)表2。表明所分離的毒株為H3 亞型豬流感病毒。

表2 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)鑒定結(jié)果

3.2.2 分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)PCR 用所合成的引物對(duì)分離獲得的病毒液進(jìn)行流感病毒亞型的鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 HA亞型鑒定結(jié)果

圖3 NA亞型鑒定結(jié)果

由圖2、圖3 可知，僅由H3 和N2 亞型鑒定引物擴(kuò)增的產(chǎn)物出現(xiàn)了目的條帶，表明該樣品的HA為H3亞型，NA為N2亞型。

3.3 純化病毒鑒定

3.3.1 血清學(xué)及分子生物學(xué)鑒定

將分離到的病毒液參照2.5 中方法連續(xù)純化3 代后擴(kuò)繁，對(duì)擴(kuò)繁的純化后病毒進(jìn)行血清學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，仍表明分離株為H3N2亞型豬流感病毒。

3.3.2 病毒的電鏡鑒定

分離到的病毒具有流感病毒的一般特征，病毒粒子直徑為80～120 nm，有囊膜，且囊膜表面有放射狀突起，即刺突和纖突。電鏡觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 豬流感病毒分離株電鏡觀察結(jié)果

3.3.3 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

選用純化后擴(kuò)繁F2 代病毒液（病毒含量為10-6.16EID50·0.1 mL-1）進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，在臨床癥狀、病毒分離和肺臟病變3個(gè)指標(biāo)中有任意兩項(xiàng)為陽(yáng)性的仔豬判為發(fā)病，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，攻毒組豬4/5發(fā)病，對(duì)照組豬5/5健活，表明分離株對(duì)豬具有較強(qiáng)的致病力。

表3 分離株病毒回歸豬試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)觀察結(jié)果

分離株病毒攻毒后豬只肺部病理變化見(jiàn)圖5。

由圖5 可知，在攻毒豬肺臟的右尖葉、右心葉、左橫膈葉、右橫膈葉上有斑點(diǎn)狀或斑塊狀肉樣實(shí)變；病理切片表明，攻毒組肺泡壁增厚，肺泡上皮細(xì)胞增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肺泡腔狹窄或閉塞。

圖5 分離株病毒攻毒后肺部病理變化情況

4 結(jié) 論

本研究從現(xiàn)地采集疑似豬流感發(fā)病豬的鼻拭子，分離獲得1株紅細(xì)胞凝集價(jià)、EID50與致病力均較高的純凈的H3N2亞型豬流感病毒，為后期的疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。