董燕婕，王磊，鄔元娟，范麗霞，趙善倉(cāng)，王文博

（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/山東省食品質(zhì)量與安全檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100）

近年來(lái)，隨著復(fù)合農(nóng)藥的大量使用和輪換用藥日漸普及，農(nóng)藥殘留現(xiàn)象比較突出［1］。農(nóng)藥殘留不僅顯現(xiàn)在農(nóng)產(chǎn)品上，土壤和水環(huán)境中也有報(bào)道。歐洲食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，30%的樣品含有多種農(nóng)藥殘留，且最高含有10種以上［2］。Hvězdová等［3］對(duì)歐洲中部75個(gè)耕地土壤中的53種農(nóng)藥和15種轉(zhuǎn)化物進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)51%的土壤檢出不低于5種農(nóng)藥。在水生態(tài)環(huán)境中，農(nóng)藥往往以復(fù)合污染物的形式存在，多種農(nóng)藥經(jīng)常共存于水體中［4］。多種農(nóng)藥組分聯(lián)合毒性效應(yīng)可能為協(xié)同效應(yīng)、拮抗效應(yīng)等，這種聯(lián)合毒性效應(yīng)的不確定性對(duì)農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)構(gòu)成潛在威脅［5］。我國(guó)在制定農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)一般僅考慮單一農(nóng)藥的風(fēng)險(xiǎn)，在各類(lèi)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中對(duì)不合格產(chǎn)品的判定也是以某一種農(nóng)藥是否超標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)，尚未考慮多種農(nóng)藥同時(shí)殘留的情況。由于農(nóng)產(chǎn)品中單個(gè)農(nóng)藥的殘留水平較低，其能夠引起的毒性效應(yīng)也較低，但在實(shí)際聯(lián)合暴露情形下則可能引起較為明顯的聯(lián)合毒性效應(yīng)。

基于近幾年國(guó)家食品及農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估數(shù)據(jù)，選取毒死蜱、克百威和聯(lián)苯菊酯為主要研究對(duì)象。毒死蜱主要通過(guò)多種作用機(jī)制引起肝功能障礙、遺傳毒性、神經(jīng)行為和神經(jīng)化學(xué)變化；主要毒性是由于抑制乙酰膽堿酯酶（AChE）而引起的神經(jīng)毒性［6］?？税偻拘暂^高，急性暴露可抑制體內(nèi)膽堿酯酶活性，導(dǎo)致流淚、流涎、瞳孔縮小、痙攣等，同時(shí)還具有生殖毒性、發(fā)育毒性、基因毒性、神經(jīng)毒性等［7］。聯(lián)苯菊酯為擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥，是一種神經(jīng)毒劑，通過(guò)干擾離子通道、損傷神經(jīng)系統(tǒng)，從而產(chǎn)生興奮性神經(jīng)毒性，出現(xiàn)神經(jīng)中毒癥狀［8］。為評(píng)估上述3種農(nóng)藥是否影響人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)或功能，使用已知具有高表達(dá)水平的神經(jīng)元型nAChRs的人神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y［9］，研究3種農(nóng)藥單獨(dú)和聯(lián)合作用SH-SY5Y細(xì)胞后的細(xì)胞毒性、凋亡率、活性氧水平、非酶和酶促抗氧化劑水平等指標(biāo)，對(duì)3種農(nóng)藥的聯(lián)合毒性作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期探明農(nóng)藥殘留混合物的聯(lián)合毒性效應(yīng)，為食品安全及人體健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人神經(jīng)母瘤細(xì)胞SH-SY5Y（本實(shí)驗(yàn)室保存）；DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購(gòu)自Gibco公司；CCK-8試劑盒、活性氧檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；SOD檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、GSH檢測(cè)試劑盒、克百威（CAS：1563-66-2，純度≥98.8%）、毒死蜱（CAS：2921-88-2，純度≥99.1%）、聯(lián)苯菊酯（CAS：82657-04-3，純度≥98.5%）標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自北京壇墨質(zhì)檢股份有限公司。

超凈工作臺(tái)（中國(guó)蘇州凈化SW -CJ-1FD）；CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO XD-101）；熒光倒置顯微鏡（日本OLYMPUS IX51）；臺(tái)式低速離心機(jī)（中國(guó)上海醫(yī)療器械股份有限公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton-Dickinson FACSCalibur）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒

SH-SY5Y細(xì)胞用含10%胎牛血清、1.0%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將3種農(nóng)藥原藥用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成100 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃儲(chǔ)存，試驗(yàn)時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至待測(cè)濃度。

1.3 細(xì)胞毒性檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞存活率檢測(cè) 采用CCK-8法測(cè)定3種農(nóng)藥單獨(dú)及混合對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響［10］。調(diào)整對(duì)數(shù)期細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL，每孔100μL接種于96孔板中孵育24 h后，棄去培養(yǎng)液，加入含不同濃度克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥及其組合的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h，克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其聯(lián)合組終濃度分別為0.01、0.1、0.5、1、10、100、1 000μg/mL，聯(lián)合組的克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1。每孔中加入10μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在450 nm下的吸收值。

1.3.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Annexin V-FITC法測(cè)定3種農(nóng)藥單獨(dú)及混合對(duì)SH-SY5Y凋亡率的影響［11］。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到六孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為10 μg/mL克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其組合，聯(lián)合組克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1，對(duì)照組不添加農(nóng)藥，培養(yǎng)48 h。用0.25%胰酶（不含EDTA）消化收集細(xì)胞；用PBS洗滌2次（1 000 r/min離心5 min），收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL；加入500μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5μL Annexin V-FITC混勻后，加入5μL Propidium Iodide，混勻；室溫、避光反應(yīng)5～15 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量 采用DCFH-DA熒光探針?lè)z測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧含量［12］。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到六孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為10μg/mL克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其組合，聯(lián)合組克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1，對(duì)照組不添加農(nóng)藥，培養(yǎng)48 h。用PBS洗滌細(xì)胞一次（1 000 r/min離心5 min），收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL；按照1∶1 000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L，將收集后的細(xì)胞懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一次，使探針和細(xì)胞充分接觸；用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)（Ex=488 nm；Em=530 nm）細(xì)胞內(nèi)活性氧情況。

1.3.4 細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化接種到六孔板中，次日待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為10μg/mL克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯及其組合，聯(lián)合組克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯比例為1∶1∶1，對(duì)照組不添加農(nóng)藥，培養(yǎng)48 h。小心吸取各組細(xì)胞0.1 mL進(jìn)行測(cè)定。超氧化物歧化酶（SOD）、脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）活性均按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行［13，14］。采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀分別在550 nm和532 nm波長(zhǎng)下測(cè)得其吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

農(nóng)藥間的相互作用類(lèi)型采用Chou-Talaly數(shù)學(xué)模型［15］分析獲得?；旌衔锏穆?lián)合毒性類(lèi)型采用CompuSyn（Compusyn Inc.，USA）［16］軟件進(jìn)行分析。CI＞1表示拮抗作用；CI=1表示加和作用；CI＜1表示協(xié)同作用。使用SPSS軟件分析并處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過(guò)Microsoft Excel軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，暴露24 h，不同濃度克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制率均低于20%，但具有濃度依賴(lài)性；暴露48 h，毒死蜱、克百威、聯(lián)苯菊酯最高濃度處理對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率分別為25.67%、20.98%和18.50%，均具有濃度依賴(lài)性。與單獨(dú)處理相比，聯(lián)合處理組對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖的抑制率極顯著增加（P＜0.01）。由圖2可知，3種農(nóng)藥在不同效應(yīng)水平下均為協(xié)同效應(yīng)（CI＜1），隨著濃度的增加，CI值逐漸減小，說(shuō)明協(xié)同作用逐漸增強(qiáng)，在效應(yīng)10%水平下，3種農(nóng)藥呈極強(qiáng)的協(xié)同作用。

圖1 3種農(nóng)藥單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的抑制率

2.2 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率的影響

圖2 48 h三種農(nóng)藥的聯(lián)合指數(shù)

圖3 雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)圖

等濃度的毒死蜱、克百威、聯(lián)苯菊酯處理SHSY5Y細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比，均能引起細(xì)胞產(chǎn)生顯著的凋亡現(xiàn)象（P＜0.05，圖3）。如表1所示，克百威處理組的細(xì)胞凋亡率為11.46%；聯(lián)苯菊酯處理組的細(xì)胞凋亡率為10.66%；毒死蜱處理組的細(xì)胞凋亡率為10.06%。三者混合作用于SHSY5Y細(xì)胞后引起的凋亡率上升到38.04%。

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

2.3 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞ROS的影響

與對(duì)照組相比，克百威、聯(lián)苯菊酯、毒死蜱處理后均使SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量ROS（P＜0.05）；3種農(nóng)藥處理之間無(wú)顯著性差異，表明3種農(nóng)藥均可以誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。聯(lián)合組與單獨(dú)組相比，產(chǎn)生ROS的水平極顯著（P＜0.01）提升（圖4）。

2.4 克百威、毒死蜱、聯(lián)苯菊酯對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞抗氧化水平的影響

通過(guò)檢測(cè)3種農(nóng)藥單獨(dú)和聯(lián)合處理SH-SY5Y細(xì)胞的SOD、GSH和MDA活性，判斷其對(duì)細(xì)胞抗氧化水平的影響（圖5）。與對(duì)照組相比，暴露于限量濃度的3種農(nóng)藥后SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH活性均顯著下降（P＜0.05），MDA活性顯著提高；3個(gè)農(nóng)藥處理組間差異不顯著。該結(jié)果表明3種試驗(yàn)農(nóng)藥均可以引起細(xì)胞抗氧化功能的顯著下降，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些農(nóng)藥可能通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)SHSY5Y細(xì)胞產(chǎn)生毒性。與單獨(dú)處理相比，聯(lián)合組極顯著降低GSH和SOD活性，提高M(jìn)DA活性。說(shuō)明3種農(nóng)藥聯(lián)合對(duì)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激的程度高于單獨(dú)處理。

圖4 3種農(nóng)藥對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生ROS的影響

圖5 3種農(nóng)藥對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中SOD、MDA、GSH活性的影響

3 討論與結(jié)論

我國(guó)是農(nóng)藥生產(chǎn)和使用大國(guó)，農(nóng)藥的普遍使用尤其是復(fù)配農(nóng)藥的興起，使多種農(nóng)藥殘留的現(xiàn)象比較突出。岳暉等［17］對(duì)山東省市售蔬菜進(jìn)行監(jiān)測(cè)表明，18.7%的產(chǎn)品（322批次）含兩種微量農(nóng)藥殘留，15.4%（265批次）的產(chǎn)品存在3種及以上微量農(nóng)藥殘留。多種農(nóng)藥在無(wú)損害作用水平下混合可產(chǎn)生復(fù)雜的聯(lián)合效應(yīng)，從而引起機(jī)體氧化應(yīng)激、肝腎功能障礙［18］。即使是微量水平下的多農(nóng)藥殘留毒性也可能是數(shù)倍或是數(shù)十倍地高于單體農(nóng)藥殘留毒性［19］。因此本試驗(yàn)選取蔬菜中檢出較多但超標(biāo)率不高的3種農(nóng)藥，采用SH-SY5Y細(xì)胞作為體外模型，研究其單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞存活率的影響。結(jié)果表明，3種農(nóng)藥單獨(dú)作用于細(xì)胞均降低其存活率，在培養(yǎng)24 h和48 h后均具有濃度依賴(lài)性。Wang等［20］在體外用不同濃度的氯化鎘和毒死蜱（50、100 mmol/L）以及其組合處理SD大鼠脾淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)毒死蜱對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖有顯著抑制作用?？税偻投舅莉鐚?duì)人肝細(xì)胞L-O2的增殖有抑制效果［21］。本試驗(yàn)表明3種農(nóng)藥聯(lián)合作用于細(xì)胞時(shí)，其毒性高于單獨(dú)處理；不同毒性效應(yīng)水平下均為協(xié)同作用，隨著毒性效應(yīng)水平的增加，CI值逐漸降低，協(xié)同效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。這說(shuō)明雖然農(nóng)產(chǎn)品中單獨(dú)農(nóng)藥殘留量低于國(guó)家限量值，但多種農(nóng)藥同時(shí)存在引發(fā)的強(qiáng)協(xié)同作用可能導(dǎo)致毒性呈數(shù)倍甚至數(shù)十倍的增大。

細(xì)胞凋亡是指在一定的病理或生理?xiàng)l件下，細(xì)胞自發(fā)地遵循自身程序，并由相關(guān)基因調(diào)控而呈現(xiàn)出的一種自主有序的死亡過(guò)程。本試驗(yàn)研究了3種農(nóng)藥單獨(dú)和聯(lián)合對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用，結(jié)果表明單獨(dú)農(nóng)藥處理可顯著引發(fā)細(xì)胞凋亡，且聯(lián)合作用細(xì)胞的凋亡率顯著高于單獨(dú)農(nóng)藥。

為研究毒性、凋亡與氧化損傷之間的關(guān)系，本研究測(cè)定了暴露于各農(nóng)藥的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS水平和GSH、SOD及MDA活性，結(jié)果表明無(wú)論單獨(dú)還是聯(lián)合處理，3種農(nóng)藥均顯著改變細(xì)胞的氧化還原因子水平，且聯(lián)合作用組的ROS含量顯著高于單獨(dú)處理組；3種農(nóng)藥均顯著降低SOD和GSH活性，增加MDA活性。說(shuō)明農(nóng)藥通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量ROS和抑制抗氧化系統(tǒng)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，證實(shí)氧化應(yīng)激是農(nóng)藥在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)引起毒性的機(jī)制之一。這與前人研究結(jié)果［22，23］類(lèi)似。

綜上所述，各農(nóng)藥單劑和組合可以抑制細(xì)胞增殖，顯著誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，并發(fā)生凋亡，但是混合農(nóng)藥誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞體外試驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)探究其凋亡靶點(diǎn)和通路，為評(píng)估農(nóng)藥多殘留聯(lián)合毒性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。