吳任燕，郭曉琳，洪登禮，陳 磊

1.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，細胞分化與凋亡教育部重點實驗室，上海200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院上海市免疫學(xué)研究所，上海200025

急性不明確譜系白血?。╝cute leukemia of ambiguous lineage，ALAL）是一種罕見的白血病類型，不能清楚地分為淋巴系和髓系，其發(fā)病率不到5%。根據(jù)2016 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）分類標準［1］，ALAL 可分為多個亞型，包括急性未分化白血?。╝cute undifferentiated leukemia，AUL）、混合表型急性白血?。╩ixed phenotype acute leukemia，MPAL）等。盡管大多數(shù)白血病已經(jīng)得到了很好的研究和治療，但由于ALAL 的罕見性，目前普遍采用的是與急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）相同的治療手段，無法對ALAL 進行針對性治療，使得ALAL 相 較 于AML/ALL 治 療 效 果 較 差［2-3］。因 此 探 究ALAL 發(fā)生和生存相關(guān)的基因和信號通路，有助于對ALAL發(fā)病機制的針對性研究，可為ALAL的臨床治療提供參考。

目前已有的研究主要針對ALAL的存活率、免疫分型以及相關(guān)microRNA 而開展。白血病生存分析［4-5］顯示，大多數(shù)ALAL患者首選ALL的治療方案；免疫表型分析［6］顯示，早期T細胞前體淋巴細胞白血病和T/M-MPAL在免疫表型上相似，NOTCH1可作為T 細胞混合表型白血病的潛在治療靶點；通過高通量測序，ALAL可以根據(jù)具有譜系特性的microRNA 表達特性被歸類為AML 或ALL［7］。這些研究大多探討了ALAL與其他白血病的譜系關(guān)系，但有關(guān)ALAL獨特的基因表達譜、生存基因以及相關(guān)通路尚不清楚。高通量測序技術(shù)自問世以來，極大地推動了對于疾病標志物的研究進展。通過對公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，我們可以對疾病的發(fā)病機制及治療靶標進行預(yù)測，為疾病的機制研究和藥物研發(fā)提供思路。

本研究利用小兒ALAL患者和健康對照組的表達譜數(shù)據(jù)（RNA-seq），對ALAL 中的差異表達基因（differential expressed genes，DEGs）進行篩選，利用基因本體數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology，GO） 和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析，探討ALAL發(fā)病的生物學(xué)過程和相關(guān)信號通路；結(jié)合生存分析與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)了在ALAL中獨特的生存基因表達譜，鑒定了與ALAL生存相關(guān)的樞紐基因。本研究可為ALAL的臨床診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 RNA-seq數(shù)據(jù)獲得

基因表達數(shù)據(jù)來自于兒童ALAL 患者和兒童健康對照者的血液或骨髓的RNA-seq 數(shù)據(jù)?；颊叩幕虮磉_數(shù)據(jù)是從UCSC xena 數(shù)據(jù)門戶GDC 下載TARGET-ALL-P3數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集由有效治療應(yīng)用研究（Therapeutically Applicable Research to Generate Effective Treatments，TARGET，https：//ocg.cancer.gov/programs/TARGET） 計劃生成。健康對照者的基因表達數(shù)據(jù)（GSE111459）從基因表達匯編數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）下載。對異常樣本進行過濾后，得到21 個健康兒童樣本和69 個初診兒童ALAL 樣本分別作為健康對照組和ALAL組。納入診斷樣本和復(fù)發(fā)樣本的數(shù)據(jù)用于不同類型白血病基因表達量比較，以TARGET-ALL-P2 的532 個ALL 樣本為ALL 組，以TARGET-AML 的187 個AML 樣本為AML 組，以TARGET-ALL-P3中的136個ALAL 患者樣本為ALAL 完全組。所有患者的數(shù)據(jù)均可從癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）獲得。

1.2 前期處理及DEGs篩選

所有樣本的表達量數(shù)據(jù)均被標準化為每百萬片段計數(shù)（count per million，CPM）值以進行相關(guān)性分析和去除低測序質(zhì)量樣本。低表達基因（在所有樣本中均CPM＜1.5）和離群基因（＜Q1-1.5×IQR或＞Q3+1.5×IQR）被移除。利用Pearson相關(guān)分析方法對樣本表達譜相關(guān)性進行分析。R語言limma軟件包［8］用于鑒別ALAL標本與健康對照組之間的差異表達基因。采用Benjamini和Hochberg 修正法對多次試驗進行修正，得到修正后的P 值（adjusted Pvalue）。為消除假陽性結(jié)果，DEGs的篩選標準為|log2Fold Change|（|log2FC|）＞2且修正后的P＜0.001。

1.3 DEGs的功能分析

為驗證數(shù)據(jù)結(jié)果的可靠性，利用R 語言DOSE 軟件包［9］進 行DEGs 的 疾 病 本 體 論（Disease Ontology，DO）［10］分 析。為 研 究ALAL 中 的 相 關(guān) 通 路，使 用clusterProfiler［11］的默認參數(shù)對上調(diào)和下調(diào)的DEGs 分別進行GO和KEGG富集分析。顯著性篩選標準為P＜0.05。

1.4 生存相關(guān)基因鑒定及其與AML/ALL的表達比較

69 例ALAL 患者中有48 個病例有總生存時間記錄，并選擇用于生存相關(guān)基因的鑒定。根據(jù)每個基因在所有樣本中的平均表達量，48個樣本被分為基因的高表達組和低表達組。生存分析采用R 語言的survival和survminer軟件包進行，Cox 回歸模型用于鑒定生存相關(guān)基因；以P＜0.05，在表達下調(diào)的基因中相關(guān)系數(shù)＞0或在表達上調(diào)的差異基因中相關(guān)系數(shù)＜0，被認為是合理的ALAL生存相關(guān)基因。生存分析是針對與正常樣本的差異基因進行，所得到的生存相關(guān)基因可能與小兒ALAL的致病相關(guān)，但這些生存相關(guān)基因的具體作用仍有待進一步的機制研究。

1.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及樞紐基因篩選

將生存相關(guān)基因?qū)隚eneMANIA［12］構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI），該網(wǎng)絡(luò)中總共包含22 個ALAL 生存相關(guān)基因以及100 個與這些基因具有功能或表達相關(guān)性的間接相關(guān)基因。利 用Cytoscape［13］繪 制PPI 網(wǎng) 絡(luò) 圖 譜，并 利 用Cytohubba［14］計算網(wǎng)絡(luò)圖中每一個基因的最大群體中心度（maximal clique centrality，MCC），得分值最高的前10個基因，被認為是PPI網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控

由于測序技術(shù)的特性，我們需要對不同來源的測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，以提高最后分析結(jié)果的準確性。在去除低質(zhì)量樣本和離群基因后，在原始數(shù)據(jù)中篩選出總共90個樣本的19 213 個基因的表達值進行后續(xù)分析，其中包括21 個健康對照組和69 個兒童ALAL 組的樣本。標準化前后的表達值如圖1A 所示。在ALAL 組和對照組中的基因表達量顯示出較高的內(nèi)部樣本相關(guān)性（圖1B），證明篩選得到的數(shù)據(jù)內(nèi)部表達譜具有均質(zhì)性，可以用于后續(xù)分析。樣本編號與原始數(shù)據(jù)編號的對應(yīng)關(guān)系見附表1。

圖1 樣本數(shù)據(jù)質(zhì)控Fig 1 Quality control of sample data

表1 生存相關(guān)基因在不同類白血病患者及健康對照者中的表達值（log2CPM）Tab 1 The log2CPM value of survival-related genes in the control and different leukemia types

2.2 DEGs篩選與功能分析

為進一步探究兒童ALAL 的異?；虮磉_譜，利用limma 軟件包對ALAL 組和健康對照組的基因表達譜進行差異分析；選擇|log2FC|＞2、校正后的P＜0.001 為條件進行基因篩選，去除假陽性基因，共鑒定得到4 053 個基因，其中上調(diào)基因1 844 個，下調(diào)基因2 209 個?；谒蠨EGs 的DO 分析表明造血系統(tǒng)疾病是最顯著富集的疾?。▓D2A），與我們的數(shù)據(jù)特征相符，進一步證明我們篩選使用的樣本數(shù)據(jù)和差異分析的合理性。對上調(diào)和下調(diào)的差異基因分別進行GO 和KEGG 富集分析，找尋與ALAL 發(fā)病相關(guān)的信號通路，各組顯著富集的前10 個生物學(xué)過程和信號通路如圖2B 及圖2C 所示。ALAL 組中與免疫相關(guān)的生物學(xué)進程、造血細胞譜系和細胞黏附分子相關(guān)的信號通路明顯下調(diào)，而細胞周期、有絲分裂以及剪接相關(guān)的生物學(xué)進程在ALAL 組中明顯富集。

圖2 差異基因的功能分析Fig 2 Functional analysis of DEGs

2.3 生存相關(guān)基因篩選及表達譜的比較

利用ALAL 患者的總體生存期資料，我們從4 053 個差異表達基因中鑒定出31 個ALAL 生存相關(guān)基因。其中13 個基因在ALAL 組中表達量增加，與生存呈負相關(guān)，被認為是負生存相關(guān)基因；18 個基因在ALAL 組中表達降低，與生存呈正相關(guān)，被認為是正生存相關(guān)基因。

此外，為了研究這些基因是特異在ALAL 中表達變化還是白血病的普遍差異基因，我們在ALL 組以及AML組的表達譜中對這些基因進行了比較分析。結(jié)果表明，與ALAL 生存相關(guān)的基因，在ALL 組以及AML 組中呈現(xiàn)出同樣的差異表達趨勢，相對于健康組，在ALAL 完全組中表達上調(diào)的基因同樣在ALL 組和AML 組中表達上調(diào)，但這些基因的表達量在各類型白血病之間仍然存在顯著差異（表1）。這些基因中也有一些“偏向性”表達特例，SMARCA5-AS1 在AML 組中的表達與對照組相比差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.151），但在ALAL完全組和ALL 組中表達較對照組有明顯增加（均P=0.000）。ZNF135在ALAL完全組和AML組中的表達值均低于對照組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000），但在ALL 患者中表達量無明顯變化（P=0.073）。這些數(shù)據(jù)為研究ALAL的獨特生存特征及治療方案的選擇提供了線索。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及樞紐基因識別

樞紐基因是在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有緊密的相互聯(lián)系，發(fā)揮核心作用的一群基因。為了進一步篩選出在ALAL 患者生存中發(fā)揮關(guān)鍵作用的樞紐基因，我們將所有生存相關(guān)基因?qū)氲紾eneMANIA 中，構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。GeneMANIA 中的GO 富集分析顯示細胞趨化性和白細胞遷移相關(guān)的生物學(xué)過程在這個相互作用網(wǎng)絡(luò)中顯著富集，提示ALAL 患者的生存與細胞趨化性及白細胞遷移相關(guān)。在這個PPI 網(wǎng)絡(luò)中MCC 得分最高的前10 個基因被認為是這個PPI 網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因（圖3B）。在這10 個基因中，只有CXCL8 和LMNA 與ALAL 的生存相關(guān)且在ALAL 組中表達量發(fā)生變化，被鑒定為ALAL 的生存相關(guān)樞紐基因。在ALAL 組和健康對照組中CXCL8 和LMNA 的生存曲線和表達譜如圖3C 和圖3D 所示，CXCL8 和LMNA 均為負生存相關(guān)基因，在ALAL組中表達上調(diào)，伴隨ALAL患者總生存期下降。

圖3 ALAL生存相關(guān)樞紐基因鑒定Fig 3 Survival-related hub genes identification and its character.

3 討論

本研究通過生物信息學(xué)分析的方法，將基因表達數(shù)據(jù)與臨床生存數(shù)據(jù)結(jié)合，對ALAL 的生存相關(guān)樞紐基因進行篩選。為使得研究結(jié)果更加準確，我們首先對公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行了篩選，得到21 個健康樣本（GSE111459） 和69 個ALAL 樣 本（TARGET-ALL-P3）的共19 213 個基因表達數(shù)據(jù)?；虮磉_譜的差異分析顯示在ALAL組中有1 844個基因表達上調(diào)，2 209個基因表達下調(diào)，揭示了ALAL 的異?；虮磉_譜。疾病本體分析的結(jié)果顯示造血系統(tǒng)疾病在差異基因中高度富集，進一步驗證了我們的數(shù)據(jù)以及差異分析的可靠性。GO 以及KEGG富集分析表明在ALAL組中上調(diào)表達的基因主要富集細胞周期以及有絲分裂的相關(guān)進程，而下調(diào)的差異基因在造血細胞譜系相關(guān)通路和免疫相關(guān)進程中富集。白血病的主要特征為造血干細胞的惡性增殖和分化障礙，因此細胞周期及有絲分裂進程的上調(diào)，造血細胞譜系相關(guān)進程的下調(diào)，符合白血病的基本特性。但目前尚未有研究指出ALAL 中免疫相關(guān)進程的下調(diào)，因此本研究中找到的通路可能為ALAL的免疫學(xué)治療提供理論依據(jù)。

結(jié)合臨床生存記錄，我們從ALAL 的差異基因中篩選出了31 個與生存相關(guān)的基因。由于目前ALAL 缺乏明確的靶向治療方案，ALAL 的治療普遍是采用ALL 或者AML 的治療方案進行，但這些治療往往帶來較差的預(yù)后效果［2-3］，因此我們將ALAL 的生存相關(guān)基因表達譜與ALL/AML 進行比較，探究特異在ALAL 中異常表達的生存基因。結(jié)果顯示大多數(shù)基因在ALAL、AML 和ALL 中具有共同的上下調(diào)趨勢，這些ALAL 的生存相關(guān)基因，在AML/ALL 中同樣差異表達，具有白血病致病的普遍性。但這些基因在各個白血病類型之間的表達譜存在明顯差異，ALAL 的生存相關(guān)基因表達量大多數(shù)介于ALL和AML 之間，表現(xiàn)出與ALAL 生存相關(guān)的特殊基因表達譜。此外我們發(fā)現(xiàn)，在這些基因中存在一些明顯的“偏向”調(diào)節(jié)的情況，如SMARCA5-AS1 在ALAL 和ALL 中表達增加，但在AML 中沒有改變；ZNF135 在ALAL 和AML 中表達下調(diào)，但在ALL 中沒有改變。這些數(shù)據(jù)可能為ALAL治療方案的選擇提供借鑒作用。

此外，通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖譜的構(gòu)建，我們進一步篩選出CXCL8 和LMNA 作為ALAL 生存相關(guān)的樞紐基因。CXCL8 又稱IL-8，是CXC 趨化因子家族的成員。CXCL8可從白細胞和非白細胞的體細胞中釋放，在炎癥中經(jīng)常上調(diào)表達，并在白細胞誘導(dǎo)遷移和釋放反應(yīng)中發(fā)揮作用［15］。近期的研究表明，白血病細胞廣泛釋放CXCL 和CCL 趨化因子，尤其是高水平地釋放CXCL8［16］；CXCL8與AML 的復(fù)發(fā)有關(guān)，CXCL8 的敲除導(dǎo)致G0/G1 細胞周期阻滯、凋亡和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 信號通路失活［17］；CXCL8 可與CXCR1/2 相互作用，調(diào)節(jié)細胞增殖和分化，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［18-19］。然而，CXCL8 在ALAL 中是否發(fā)揮作用尚不清楚。在本研究中，CXCL8 在ALAL中表達上調(diào)；并在ALAL 患者的生存中充當樞紐基因，ALAL 患者中富集與細胞周期相關(guān)的信號通路，CXCR1/2在ALAL 中表達下調(diào)，結(jié)合已有報道，我們推測CXCL8可能通過參與細胞周期的進程介導(dǎo)了ALAL 的發(fā)生和發(fā)展，而并非通過與CXCR1/2 相互作用參與ALAL 的發(fā)生。LMNA 編碼核包膜蛋白lamin A 和lamin C，主要參與染色質(zhì)組織、核組裝和端粒動力學(xué)，與涉及凋亡和存活的Caspase 級聯(lián)途徑有關(guān)。LMNA 突變引起多種疾病［20-21］，但在白血病中對LMNA 的研究非常少。此前，有報道稱LMNA 在活性T 細胞中被誘導(dǎo)表達［22］，但LMNA 在造血細胞中的表達情況尚不明確。通過高通量測序數(shù)據(jù)，我們在對照組和ALAL 組中均檢測到LMNA，并且LMNA 在ALAL患者中的表達明顯高于對照組。我們的結(jié)果首次提出LMNA在ALAL的發(fā)生和生存中發(fā)揮作用。

綜上所述，我們對兒童ALAL 病例的獨特基因表達譜進行了研究，確定了參與ALAL 發(fā)生的信號通路及生物學(xué)進程，并將ALAL 生存相關(guān)基因的表達譜與ALL 和AML 的表達譜進行了比較，為研究ALAL 的獨特生存特征和現(xiàn)有治療方案的選擇提供了線索?；谏嫫诜治稣业搅薃LAL生存相關(guān)樞紐基因，可能作為潛在的ALAL治療靶點，但這些樞紐基因的功能仍有待進一步驗證。