葉浡之，梁曉荷，趙翊含，薛淇澤，黃周青，蔡雪黎

1.溫州市心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┦切难芟到y(tǒng)常見疾病，是人類致死的主要原因之一[1]。在冠心病的早期階段即動(dòng)脈粥樣硬化起始階段給予干預(yù)是預(yù)防冠心病的有效策略[2]。單核細(xì)胞在趨化因子的作用下遷入內(nèi)皮膜下活化為巨噬細(xì)胞[3]，吞噬同樣在內(nèi)膜下積聚的氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL），促進(jìn)早期斑塊脂質(zhì)條紋的形成，同時(shí)巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子，在動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程中持續(xù)發(fā)揮作用[4]。探索ox-LDL刺激下巨噬細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)有助于更好地理解動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理機(jī)制。

環(huán)狀RNAs（circRNAs）是近年來(lái)非編碼RNA研究中的明星分子，能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控mRNA的表達(dá)，進(jìn)而在心血管疾病如高血壓[5]、心力衰竭[6]、心肌梗死[7]過程中發(fā)揮重要作用，但circRNAs是否可以通過調(diào)控ox-LDL刺激下的巨噬細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展尚未見報(bào)道。因此，本研究利用ox-LDL構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥模型，通過基因芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)circRNAs在ox-LDL刺激下的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的潛在作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及巨噬細(xì)胞炎癥模型制備 THP-1細(xì)胞購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)（American type culture collection，ATCC）。在37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中使用1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青鏈酶素混合液）培養(yǎng)THP-1細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為對(duì)照組和ox-LDL組。將THP-1細(xì)胞以每孔1×106個(gè)接種在六孔板中，用終濃度為100 nmol/L的佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）處理48 h，誘導(dǎo)THP-1分化為貼壁的巨噬細(xì)胞，并給予ox-LDL（50 μg/mL）刺激巨噬細(xì)胞24 h構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥模型作為ox-LDL組[8]。對(duì)照組細(xì)胞誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后，不給予ox-LDL刺激。

1.2 油紅染色 細(xì)胞經(jīng)過ox-LDL刺激24 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，加固定液固定30 min。隨后棄固定液，用蒸餾水清洗2遍，加入60%異丙醇浸洗5 min。棄異丙醇后根據(jù)油紅染色試劑盒說明書（北京索萊寶科技有限公司）進(jìn)行后續(xù)染色實(shí)驗(yàn)。封片后光鏡下觀察并拍照。

1.3 ELISA檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)過ox-LDL刺激24 h后收集細(xì)胞上清液，根據(jù)ELISA說明書（上海西唐生物科技有限公司）分別進(jìn)行IL-1β、IL-6及TNF-α含量的檢測(cè)。

1.4 RNA提取與芯片檢測(cè) 細(xì)胞處理后棄上清液，用預(yù)冷的PBS洗滌后，用Qiagen試劑盒提取大于5 μg的總RNA樣品，并用RNasey Mini Kit（Qiagen p/n74104）進(jìn)行RNA的純化。采用Quick Amp Labeling Kit，One-Color（Agilent p/n 5190-0442）對(duì)RNA樣本進(jìn)行熒光Cy3標(biāo)記及效率控制。運(yùn)用Agilent Gene Expression Hybridization Kit（Agilent p/n 5188-5242）將標(biāo)記的RNA與circRNA芯片雜交。通過激光掃描儀[Agilent Microarray Scanner（Agilent p/n G2565BA）]對(duì)Cy3特異性熒光標(biāo)記的圖像進(jìn)行采集，通過Agilent Feature Extraction軟件對(duì)雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換。

1.5 qRT-PCR 細(xì)胞處理完成后加預(yù)冷的PBS洗滌，用TRIzol試劑盒提取細(xì)胞內(nèi)的RNA。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑說明書[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。隨后利用qRT-PCR檢測(cè)circRNA的相對(duì)含量。

1.6 差異circRNAs的篩選及基因本體（gene ontology，GO）分析 在使用Agilent Feature Extraction軟件對(duì)雜交圖像進(jìn)行數(shù)字化轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選差異表達(dá)的circRNAs。在進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)首先扣除背景，計(jì)算重復(fù)點(diǎn)平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，然后通過LOWESS（Locally-Weighted Regression）過濾進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。計(jì)算兩組（對(duì)照組和ox-LDL組）檢測(cè)信號(hào)的比值（log2）和t檢驗(yàn)的P值。以P＜0.05為顯著差異性表達(dá)。數(shù)據(jù)處理結(jié)果進(jìn)行均一化后，篩選出差異表達(dá)的circRNAs。對(duì)mRNA芯片結(jié)果中差異基因進(jìn)行GO分析，以判斷差異基因主要涉及的生物學(xué)功能。

1.7 基因共表達(dá)分析 基于circRNA和mRNA芯片結(jié)果，通過Genecards、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)及DAVID 6.7工具進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用基因相關(guān)度篩選，將circRNAs及與其相關(guān)度高的mRNAs做共表達(dá)分析。1.8 circRNA靶基因預(yù)測(cè) 通過TargetScan和miRanda數(shù)據(jù)庫(kù)以及Starbase軟件預(yù)測(cè)與circRNA存在潛在結(jié)合的miRNAs。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用GraphPad Pro Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次，以±s表示，兩組間比較采用Student’s t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建 ox-LDL刺激單核源巨噬細(xì)胞后，油紅染色鏡下觀察到巨噬細(xì)胞中脂滴增多（見圖1A），細(xì)胞上清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量在ox-LDL組中均有上調(diào)（P＜0.05，見圖1B-D），說明巨噬細(xì)胞炎癥模型構(gòu)建成功。

2.2 circRNAs芯片結(jié)果分析 細(xì)胞造模成功后，利用Arraystar Human circRNA芯片篩選差異表達(dá)的circRNAs，結(jié)果如圖2A所示，在散點(diǎn)圖中的縱坐標(biāo)是樣本歸一化后的信號(hào)值（log2縮放），在頂端綠色折線和底端綠色折線之間的信號(hào)點(diǎn)是篩選后在對(duì)照組和ox-LDL組中差異表達(dá)大于1.5倍的circRNAs。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如圖2B火山圖所示，兩條垂直的綠色折線對(duì)應(yīng)于1.5 倍差異，水平綠色折線代表P值為0.05，可以看出其中有7條circRNAs在ox-LDL組中差異表達(dá)顯著。圖2C為芯片分析得出的7 條circRNAs在對(duì)照組與ox-LDL組中的相對(duì)表達(dá)量，其中綠色表示低表達(dá)量，紅色表示高表達(dá)量，結(jié)果顯示，5條circRNAs表達(dá)上調(diào)，2條circRNAs表達(dá)下調(diào)。

圖1 ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞的炎癥模型構(gòu)建

圖2 芯片篩選ox-LDL刺激下巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)的circRNAs

2.3 細(xì)胞內(nèi)circRNAs表達(dá)量的驗(yàn)證 qRT-PCR檢測(cè)7 條circRNA在細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果提示除circRNA_0026218 無(wú)變化外，其余4 條circRNAs（circRNA_0008896、circRNA_0007478、circRNA_0007085和circRNA_0092327）在ox-LDL刺激后的巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，2條circRNAs（circRNA_0048492和circRNA_0082139）表達(dá)下調(diào)，見表1。

2.4 GO分析 GO分析結(jié)果顯示，ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞的過程中具有差異表達(dá)的mRNAs與細(xì)胞因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面密切相關(guān)，而其分子功能也涉及基因轉(zhuǎn)錄、受體活性調(diào)節(jié)等方面，細(xì)胞組分主要涉及脂蛋白顆粒。評(píng)分前十的結(jié)果見圖3。

表1 ox-LDL刺激下巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)circRNAs

圖3 ox-LDL刺激下巨噬細(xì)胞中差異表達(dá)mRNAs的GO分析

2.5 circRNAs與mRNAs共表達(dá)分析 根據(jù)circRNA及mRNA芯片分析結(jié)果，將7 條差異表達(dá)顯著的circRNAs與mRNAs做了共表達(dá)分析，結(jié)果如圖4基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖所示，與這7條circRNAs存在共表達(dá)的mRNAs參與動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。

2.6 CircRNA_0007478 的功能預(yù)測(cè) 目前對(duì)circRNAs研究較多的是circRNAs作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA（ceRNA）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNA進(jìn)而調(diào)控下游靶蛋白的表達(dá)，發(fā)揮效應(yīng)。本研究選取了circRNA_0007478做進(jìn)一步分析。如圖5A所示，通過TargetScan和miRanda 數(shù)據(jù)庫(kù)以及Starbase 軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，circRNA_0007478與5條miRNAs（miRNA-765、miRNA-412、miRNA-487a、miRNA-619、miRNA-651）存在堿基配對(duì)關(guān)系，可能為其靶基因，其中miRNA-765被報(bào)道與心血管疾病可能相關(guān)。對(duì)miRNA-765的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-765下游有多個(gè)靶基因與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)。如圖5B所示，將與circRNA_0007478共表達(dá)的mRNAs與miRNA-765潛在的靶mRNAs取交集發(fā)現(xiàn)，人RecQ解螺旋酶3（WRN）這個(gè)基因與circRNA_0007478 存在共表達(dá)，且是miRNA-765潛在的靶基因。

圖4 ox-LDL刺激下巨噬細(xì)胞中circRNAs與mRNAs的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 circRNA_0007478靶基因預(yù)測(cè)

3 討論

本研究基于基因芯片技術(shù)及生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞過程中存在circRNAs的差異表達(dá)。基于mRNA芯片的GO分析和共表達(dá)分析，差異表達(dá)的mRNAs與炎癥、細(xì)胞因子及信號(hào)通路調(diào)節(jié)密切相關(guān)，提示在ox-LDL刺激的巨噬細(xì)胞中，circRNAs的功能研究可以從炎癥方面進(jìn)行探索。

利用circRNA芯片可以高通量地篩選在疾病發(fā)生過程發(fā)生變化的circRNAs，但是芯片的結(jié)果存在一定的假陽(yáng)性，因此我們利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果提示除circRNA_0026218無(wú)變化外，其余4條circRNAs在ox-LDL刺激后的巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，2條circRNAs表達(dá)下調(diào)，且變化倍數(shù)與芯片結(jié)果相近，提示芯片檢測(cè)的質(zhì)量可。

近年來(lái)，人們對(duì)circRNAs作用機(jī)制的研究也更為深入[9]。已發(fā)現(xiàn)circRNAs可通過堿基互補(bǔ)配對(duì)，直接調(diào)控其他RNA水平[10]。目前有關(guān)circRNAs調(diào)控機(jī)制研究較多的是ceRNA[11]，即circRNAs通過“海綿”樣吸附miRNA，使miRNA無(wú)法與靶基因結(jié)合，從而間接調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)。在基因芯片篩選出差異表達(dá)的circRNAs之后，如何選定一條circRNA進(jìn)行后續(xù)的研究是一大難點(diǎn)。在本研究中，將PCR驗(yàn)證后有差異表達(dá)的6條circRNAs作為分析的對(duì)象，利用生物信息學(xué)分析circRNAs潛在靶miRNAs，結(jié)果提示miRNA-765與circRNA_0007478存在堿基互補(bǔ)配對(duì)，可能為其潛在的靶基因。此外，miRNA-765被報(bào)道在冠心病患者與健康人群間的外周循環(huán)血漿中的含量存在差異[12]，而其余circRNAs預(yù)測(cè)的潛在靶miRNAs尚未見報(bào)道與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，因此挑選circRNA_0007478做進(jìn)一步的探索。

miRNA發(fā)揮作用需通過調(diào)控它下游靶基因的表達(dá)，因此，針對(duì)miRNA-765的靶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-765下游有多個(gè)靶基因被報(bào)道與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)，其中大鳥苷三磷酸酶分子家族成員2（DNM2）[13]和腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白超家族成員C6（ABCC6）[14]等被報(bào)道與膽固醇代謝有關(guān)，軸突導(dǎo)向因子-1（NTN1）[15]和特異性蛋白-2轉(zhuǎn)錄因子（SP2）[16]等與炎癥反應(yīng)相關(guān)，血管抑素1（VASH1）[17]、鈣網(wǎng)蛋白（CALR）[18]、圓柱瘤基因（CYLD）[19]等與內(nèi)皮損傷相關(guān)，這提示miRNA-765可能參與調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。此外，基于ceRNA機(jī)制，將與circRNA_0007478共表達(dá)的mRNAs與miRNA-765潛在的靶mRNAs取交集發(fā)現(xiàn)，WRN這個(gè)基因與circRNA_0007478存在共表達(dá)，且是miRNA-765潛在的靶基因。文獻(xiàn)回顧表明WRN基因的突變與Werner綜合征相關(guān)，而Werner綜合征臨床表現(xiàn)有動(dòng)脈硬化[20]，但WRN與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病具體調(diào)控機(jī)制尚未見研究報(bào)道，這提示，以WRN為切入點(diǎn)，闡明circRNA_0007478參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的具體機(jī)制成為可能。但上述結(jié)果僅僅基于軟件推測(cè)，circRNA_0007478是否與miRNA-765存在真實(shí)結(jié)合情況需要分子實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)，例如進(jìn)行熒光霉素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，或通過干擾miRNA-765觀察circRNA_0007478對(duì)miRNA-765下游蛋白表達(dá)的影響。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的模型后進(jìn)行芯片檢測(cè)，篩選出差異表達(dá)的cricRNAs，并利用qRT-PCR證實(shí)了circRNA_0008896、circRNA_0007478、circRNA_0007085和circRNA_0092327在ox-LDL刺激后表達(dá)上調(diào)，circRNA_0048492和circRNA_0082139表達(dá)下調(diào)。此外，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)circRNA_0007478可能通過結(jié)合miRNA-765影響下游蛋白的表達(dá)進(jìn)而在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中發(fā)揮作用。