姚佳麗，徐海能，范齊昀，董昭駿，吳建章

溫州醫(yī)科大學 藥學院 化學生物學研究中心，浙江 溫州 325035

胃癌的發(fā)生與食用熏烤、鹽腌食品等飲食習慣密切相關，因此其在我國等東亞人群中發(fā)病率極高，其中我國胃癌發(fā)病例數約占全球50%[1]。近年來由于胃鏡等檢測手段的普及，胃癌的早期診斷率在日本、韓國已分別高達60%、70%。而我國的早期胃癌診斷率仍然較低（＜10%），70%胃癌患者為進展期或晚期，化療是進展期或晚期胃癌除外科手術以外的必備治療手段[1-2]。但目前被批準用于胃癌臨床治療的靶向藥物僅針對HER2和VEGFR靶點，氟尿嘧啶等傳統細胞毒類化療藥物仍然是一線化療用藥，而該類藥物具有非常大的不良反應[1，3]。

五味子丙素為木質素的一種，也是中藥五味子中主要的活性成分之一，具有保肝[4]、抗氧化[5-6]、抗炎[7]等藥理學活性。近年來相繼發(fā)現木質素類化合物也具有較好的抗腫瘤活性，但是目前有關五味子丙素抗腫瘤活性的報道極少。本研究分析了五味子丙素的體外抗胃癌活性及其對臨床化療藥物的體外增敏活性，為五味子丙素在臨床中的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細胞AGS（上海生命科學研究院細胞資源中心），五味子丙素（成都普思生物科技有限公司），MTT粉末（上海碧云天生物技術有限公司），PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（美國Gibco公司），凋亡試劑盒（美國BD Biosciences Clontech公司），Cleaved-PARP抗體、Bax抗體（美國Cell Signaling Technology公司），Bcl-2抗體（美國Santa Cruz公司），GAPDH抗體（杭州賢至生物科技有限公司），結晶紫染色液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：AGS細胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 MTT實驗：將AGS細胞消化鋪板，待細胞貼壁后，加藥。藥物孵育72 h后加入MTT溶液，4 h后吸去培養(yǎng)基，加入DMSO，在微型振蕩儀上振蕩至甲臜完全溶解后用酶標儀測定吸光值（OD值）。抑制率=（1-藥物組吸光度的平均值/DMSO組吸光度的平均值）×100%。在測定藥物對細胞生長抑制活性的半數抑制濃度（IC50）中，藥物設置9個濃度（100、80、70、60、50、40、35、20、10 μmol/L），用Graphpad 7.0計算IC50。

1.2.3 細胞集落克隆形成實驗：取AGS細胞鋪入6孔板（5 000個細胞/孔）。培養(yǎng)20 h細胞貼壁后加五味子丙素，設置DMSO組、五味子丙素10 μmol/L組、五味子丙素20 μmol/L組、五味子丙素30 μmol/L組、五味子丙素40 μmol/L組。96 h后換液（同時再加五味子丙素）。7 d后，棄培養(yǎng)基，常規(guī)清洗后4%多聚甲醛固定。常規(guī)清洗后加結晶紫染色液。最后回收結晶紫染色液，常規(guī)清洗后晾干拍照。

1.2.4 流式細胞儀測定細胞凋亡：取AGS細胞鋪于6 孔板（20 萬個細胞/孔），20 h細胞貼壁后換液加五味子丙素。分別設置DMSO組、五味子丙素20 μmol/L組、五味子丙素40 μmol/L組、五味子丙素60 μmol/L組。藥物孵育36 h后，收集全部細胞，PBS洗后，離心棄去PBS。加入稀釋后的Annexin V binding buffer，在加Annexin V/PI共染。染色結束，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，FlowJo 7.6軟件處理實驗數據。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關蛋白表達：取AGS細胞鋪于6孔板，每孔20萬個細胞。20 h細胞貼壁后加五味子丙素，藥物分組同上。藥物作用30 h后提總蛋白，制備蛋白樣品。總蛋白常規(guī)電泳、轉膜、封閉、抗體孵育（一抗1:1 000稀釋，二抗1:5 000稀釋）、常規(guī)洗膜，隨后在凝膠成像系統下檢測目的蛋白，并用Image Lab軟件進行處理分析。

1.3 統計學處理方法 應用Graphpad Prism 7.0軟件繪圖，SPSS18.0統計軟件對數據進行統計學分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 五味子丙素抑制胃癌細胞生長 五味子丙素具有較好的體外抗胃癌活性，其IC50為（35.73±5.73）μmol/L（見圖1）。集落形成實驗顯示，五味子丙素也能以濃度劑量依賴性地抑制AGS細胞生長，在濃度為20 μmol/L時對集落的形成就具有很好的抑制作用（見圖2）。

圖2 五味子丙素對AGS集落形成的影響

2.2 五味子丙素誘導AGS凋亡 流式細胞儀測定結果發(fā)現，五味子丙素在40 μmol/L時就能明顯誘導胃癌細胞凋亡，并呈現出一定的濃度依賴性，其在濃度為40 μmol/L和60 μmol/L時細胞總凋亡率分別為32.1%和38.4%，晚期凋亡率分別為20.9%和22.8%，因此主要表現為晚期凋亡（見圖3）。

2.3 五味子丙素對凋亡蛋白表達的影響 Western blot檢測五味子丙素對凋亡相關蛋白表達的影響，結果發(fā)現50 μmol/L的五味子丙素孵育細胞24 h后就能夠明顯上調凋亡蛋白Cleaved-PARP，并下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達（見圖4A）；不同濃度梯度的五味子丙素孵育細胞后，對Cleaved-PARP和Bcl-2的影響呈現出一定的濃度依賴性，在40 μmol/L下就表現出明顯的活性（見圖4B）。但是，五味子丙素對凋亡蛋白Bax的表達沒有明顯的影響。

圖3 五味子丙素對AGS凋亡的影響

2.4 五味子丙素對5-FU的增敏活性 用MTT法進一步研究了五味子丙素對5-FU的增敏活性。結果顯示設置的9 個聯合用藥濃度組合均具有比相應單藥更強的抑制細胞生長活性（其中五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L和五味子丙素40 μmol/L+5-FU 2 μmol/L聯合組與5-FU 2 μmol/L單藥組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 3 μmol/L聯合組與5-FU 3 μmol/L單藥組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L聯合組與5-FU 4 μmol/L單藥組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；五味子丙素20 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素20 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素20 μmol/L單藥組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L、五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素30 μmol/L單藥組比較差異有統計學意義（P ＜0.05）；五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素40 μmol/L單藥組比較差異有統計學意義（P＜0.05），可知五味子丙素表現了較好地增敏5-FU的抗胃癌活性。

3 討論

圖4 五味子丙素不同時間（A）和不同濃度（B）孵育對AGS凋亡相關蛋白表達的影響

圖5 五味子丙素增敏5-FU的抗胃癌活性

五味子是一種在我國應用最廣泛的滋補中藥之一，在《神農本草經》中列五味子為上品，藥用價值極高，能滋補強壯之力，有強身健體之效。五味子的主要活性成分為木質素，主要包括五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素[8]。研究顯示，五味子的保護心臟和心血管、肝臟等作用與木質素類的抗炎、抗氧化活性密切相關[8]。近年來的研究顯示，木質素類成分也具有良好的抗腫瘤活性，其中五味子乙素和五味子甲素都有較多的研究報道。如五味子乙素對肺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤均具有較好的體外抗腫瘤活性[9]；對膠質瘤、乳腺癌具有良好的體外和體內抗腫瘤活性[9]；五味子甲素對膽管癌[10]、結腸癌[11]、乳腺癌[12]、胰腺癌[13]均具有良好的體外腫瘤活性，對肺癌具有良好的體內外抗腫瘤活性[14]。而五味子丙素抗腫瘤活性的研究報道極少，目前僅PARK等[15]報道其通過抑制U937細胞的生長、阻滯周期和誘導凋亡來發(fā)揮抗腫瘤活性；LU等[16]報道其能較好地抑制肝癌細胞（Bel-7402）的生長[IC50=（81.58±1.06）μmol/L]。本研究發(fā)現五味子丙素能較好地抑制胃癌細胞生長，并能夠明顯影響凋亡相關蛋白（Cleaved-PARP、Bcl-2）的表達，誘導胃癌細胞凋亡。

靶向藥物是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點，目前已有多種該類藥物上市。但是，胃癌的靶向藥物極少，應用于臨床的僅有HER2抑制劑曲妥珠單抗和VEGFR抑制劑雷莫蘆單抗，這導致了目前從靶向藥物獲益的胃癌患者極其有限[1]。因此胃癌化療的一線主要用藥仍然是氟尿嘧啶等經典細胞毒類化療藥物，而該類藥物的選擇性差，在靶向腫瘤的同時，對正常細胞核組織也具有很大的殺傷作用，不良反應非常大[1]。聯合用藥是解決此類問題的有效策略，最理性的聯合藥物應該是：能夠對化療藥物增敏，且不增加不良反應，甚至可以降低化療不良反應。但是，目前一般的聯合用藥策略均注重增敏，而安全性被忽略了，因此聯合用藥會帶來更大的不良反應。從具有器官保護作用的藥物中挖掘聯合用藥藥物是最佳策略，如五味子乙素能使實驗小鼠的心臟免受抗腫瘤藥物多柔比星引起的不良反應，對鉑類化合物引起的腎臟毒性具有緩解作用[9]。本研究發(fā)現五味子丙素具有很好地增敏5-FU的體外抗胃癌活性。由于五味子丙素對肝臟等器官也具有很好的保護作用，預期其對胃癌化療增敏的同時，極大可能也會具有降低氟尿嘧啶類化療毒性的作用，但其體內增敏和降低不良反應的藥效還有待進一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現五味子丙素不僅具有較好的體外抗胃癌活性，也具有明顯增敏胃癌化療的作用，可能成為低毒的胃癌化療候選新藥。