沈鑫鑫 金 磊 趙 倩 迪力夏提·金斯汗 朱麗萍 楊 亮

乳腺癌發(fā)病率位于女性惡性腫瘤的第1位。盡管乳腺癌在診療水平上已取得重大進(jìn)展，但部分乳腺癌患者的預(yù)后仍不能令人滿意，其中浸潤(rùn)性乳腺癌易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和治療抵抗。乳腺癌細(xì)胞浸潤(rùn)和通過(guò)腫瘤滋養(yǎng)血管轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，血管抑制蛋白(vasohibin, VASH)家族中VASH-2蛋白與腫瘤的發(fā)生及血管生成相關(guān)。有研究報(bào)道，VASH-2是一種內(nèi)皮細(xì)胞非固有的不依賴血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的促血管生成因子。VASH-2在肝細(xì)胞惡性腫瘤、胃惡性腫瘤、和胰腺惡性腫瘤中均有表達(dá)并且能夠促進(jìn)腫瘤新生血管形成，在癌細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。然而，VASH-2對(duì)乳腺癌的具體作用尚不清楚。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VASH-2在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步研究其功能和機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月1日至2013年12月31日新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院185例原發(fā)性乳腺癌病例為研究對(duì)象：患者年齡30～70歲，平均(48.60±11.21)歲；未絕經(jīng)者100例，絕經(jīng)者85例。收集患者年齡、絕經(jīng)情況、腫瘤大小、細(xì)胞學(xué)分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理免疫組織化學(xué)方法確診為乳腺癌；②術(shù)前未接受新輔助治療；③卡式評(píng)分(Karnofsky performance status, KPS)≥90分，接受手術(shù)治療者；④無(wú)其他系統(tǒng)惡性腫瘤病史；⑤術(shù)前同意標(biāo)本采集并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移乳腺癌及特殊類(lèi)型浸潤(rùn)性乳腺癌(炎性乳腺癌、肉瘤、微乳頭狀癌、粘液癌、小管癌、髓樣癌)者。

1.2 方法 術(shù)前采用B超血管成像了解病灶血流分布情況，并在其引導(dǎo)下對(duì)乳腺癌病灶富血供區(qū)域及乏血供區(qū)域進(jìn)行穿刺(血流豐富程度的分級(jí)通常分為四級(jí)：0級(jí)為腫塊內(nèi)未見(jiàn)血流信號(hào)顯示；1級(jí)為少量血流，腫塊內(nèi)見(jiàn)1～2個(gè)點(diǎn)狀血流信號(hào)；2級(jí)為中量血流，腫塊內(nèi)見(jiàn)3～4個(gè)點(diǎn)狀血流信號(hào)或一條壁管清晰的血管；3級(jí)為豐富血流，腫塊內(nèi)見(jiàn)4個(gè)以上點(diǎn)狀血流或2條管壁清晰的血管。定義0～1級(jí)為乏血供區(qū)域，2～3級(jí)為富血供區(qū)域)，并取出相應(yīng)區(qū)域組織；在術(shù)中取得乳腺癌及癌旁組織標(biāo)本，對(duì)所有標(biāo)本采用免疫組化(Immunohistochemistry)SP法染色，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行染色，采用微波法進(jìn)行抗原修復(fù)。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定 由3名病理科醫(yī)師采用盲法判讀免疫組化染色結(jié)果，染色結(jié)果判讀采用EnVison法。標(biāo)本處理：10%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，采用免疫組化自動(dòng)染色儀染色。以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替VASH-2一抗(美國(guó)Proteintech公司，兔抗人VASH-2多克隆抗體，稀釋比為1∶1 000)作為陰性對(duì)照，光鏡下觀察。VASH-2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色染色顆粒，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度，分為未著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色；采用半定量結(jié)果判斷，分別對(duì)鏡下陽(yáng)性表達(dá)的百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分。①陽(yáng)性細(xì)胞著色細(xì)胞數(shù)：每張切片上觀察5～10個(gè)高倍鏡視野(×100)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。②陽(yáng)性細(xì)胞著色強(qiáng)度：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。③上述兩者計(jì)分相乘即為陽(yáng)性等級(jí)：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。其中，定義0～4分為VASH-2低表達(dá)，5～12分為VASH-2高表達(dá)。雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)表達(dá)依據(jù)2010年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)判讀。人表皮生長(zhǎng)因子-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2 )表達(dá)依據(jù)2013年美國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)/美國(guó)病理學(xué)家學(xué)會(huì)乳腺癌HER-2檢測(cè)指南判讀，其中免疫組化結(jié)果提示HER-2蛋白(++)的樣本需再行熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測(cè)明確HER-2表達(dá)狀態(tài)。

1.4 觀察指標(biāo) 比較乳腺癌組織及癌旁組織VASH-2表達(dá)情況；比較乳腺癌組織VASH-2在乳腺癌富血供病灶和乏血供病灶中的表達(dá)情況；搜集患者臨床資料，比較不同病理參數(shù)(年齡、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、ER表達(dá)、是否絕經(jīng)及腫瘤細(xì)胞學(xué)分級(jí)、腫塊大小、分子分型、HER-2表達(dá)情況)乳腺癌患者VASH-2表達(dá)量的差異。

隨訪截至2019年1月，中位隨訪時(shí)間38個(gè)月(8～60個(gè)月)，采用Kaplan-Meier 法分析乳腺癌病灶中不同VASH-2表達(dá)情況對(duì)患者5年無(wú)病進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)的影響。

2 結(jié)果

2.1 VASH-2 蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，VASH-2蛋白主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色染色顆粒。VASH-2在乳腺癌病灶中多呈高表達(dá)，表達(dá)率為52.43%(97/185)，而在癌旁組織中表達(dá)率為27.03%(50/185)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=24.933,

P

<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 VASH-2在乳腺癌不同區(qū)域組織中表達(dá)情況 (SP×100)

2.2 VASH-2蛋白在乳腺癌富血供和乏血供病灶中的表達(dá)情況 免疫組化染色結(jié)果顯示，VASH-2在乳腺癌病灶中富血供區(qū)域多呈高表達(dá)，表達(dá)率為60.82%(59/97)，而在乏血供區(qū)域表達(dá)率為38.64%(34/88)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ=9.087,

P

<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 VASH-2在乳腺癌組織富血供和乏血供區(qū)域中的表達(dá)情況 (SP×100)

2.3 不同臨床病理參數(shù)患者VASH-2蛋白表達(dá)情況比較 不同腫塊大小、分子分型及HER-2是否陽(yáng)性的乳腺癌患者VASH-2表達(dá)情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

<0.05)。見(jiàn)表1。2.4 VASH-2表達(dá)情況與患者預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier法生存分析結(jié)果顯示，VASH-2低表達(dá)組5年P(guān)FS優(yōu)于VASH-2高表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

χ

=5.635,

P

=0.018)。見(jiàn)圖3。

表1 不同臨床病理參數(shù)患者VASH-2蛋白表達(dá)情況比較

圖3 VASH-2高表達(dá)和低表達(dá)組5年P(guān)FS比較

3 討論

近年來(lái)乳腺癌發(fā)病率逐年升高，已成為中國(guó)婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤，部分乳腺癌具有惡性程度高、易內(nèi)臟轉(zhuǎn)移、5年總生存率低等特點(diǎn)。腫瘤血管形成促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖并形成了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的通道，氧氣和營(yíng)養(yǎng)成分通過(guò)新生血管到達(dá)腫瘤細(xì)胞，直接影響腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)惡性程度較高的乳腺癌多有豐富的血流及豐富的淋巴管網(wǎng)，腫瘤細(xì)胞通過(guò)血管及淋巴管出現(xiàn)淋巴結(jié)及血道遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。血管新生相關(guān)因子VASH-2在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮了積極作用。相關(guān)基因表達(dá)分析研究結(jié)果顯示，VASH-2是一種新發(fā)現(xiàn)的血管新生影響因子，在多種腫瘤如肝細(xì)胞癌、胃癌和胰腺癌等癌細(xì)胞中均有表達(dá)。研究表明VASH-2在人和小鼠胚胎發(fā)育期的內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，出生后表達(dá)消失；VASH-2促使人乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，降低癌細(xì)胞中VASH-2的基因表達(dá)在理論上能明顯控制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤血管生成。

本研究結(jié)果顯示，VASH-2表達(dá)情況在富血供乳腺癌組織和乏血供乳腺癌組織中存在差異(

P

<0.05)。正常情況下，VASH-2促進(jìn)血管生成；隨著腫瘤發(fā)生發(fā)展，腫瘤細(xì)胞能夠分泌更多VASH-2因子促進(jìn)血管生成，血管向腫瘤病灶延伸，腫瘤通過(guò)血管獲取更多養(yǎng)分及通過(guò)血管通道轉(zhuǎn)移。這提示VASH-2與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)。分析原因可能是血管生成增加導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞通過(guò)血管通道出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，或通過(guò)血運(yùn)轉(zhuǎn)移促進(jìn)疾病進(jìn)展，提示VASH-2可以作為預(yù)測(cè)乳腺癌惡性程度的標(biāo)志物。有研究發(fā)現(xiàn)，VASH-2異常表達(dá)和肝癌、食管癌預(yù)后相關(guān)。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌病灶中VASH-2低表達(dá)組的5年P(guān)FS優(yōu)于VASH-2高表達(dá)組 (

P

=0.018)，這與部分學(xué)者研究結(jié)果一致。關(guān)于VASH-2異常表達(dá)影響患者預(yù)后的具體機(jī)制，有待后續(xù)研究進(jìn)一步探討。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同腫塊大小、分子分型及HER-2是否陽(yáng)性的乳腺癌患者VASH-2表達(dá)情況比較，差異顯著(

P

<0.05)。提示VASH-2異常表達(dá)和乳腺癌分子分型相關(guān)，VASH-2在三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)中多呈現(xiàn)高表達(dá)，這可能與TNBC容易發(fā)生內(nèi)臟轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

綜上所述，乳腺癌病灶中VASH-2 表達(dá)量明顯高于癌旁病灶，且富血供病灶中VASH-2的表達(dá)量高于乏血供病灶，其高表達(dá)可能與乳腺癌血管生成相關(guān)，VASH-2表達(dá)情況和乳腺癌預(yù)后相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為回顧性小樣本研究，且可能存在研究過(guò)程中隨訪樣本不足，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡的樣本數(shù)較少，存在檢驗(yàn)誤差等，因此VASH-2在乳腺癌中所起的作用仍需以后更多的臨床大樣本研究證實(shí)。