彭莎 姚楠 盧巖巖 許學(xué)猛，2△ 吳淮，2 劉文剛，2 黃雪君 陳國(guó)材

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是一種以軟骨退變?yōu)橹饕卣鞯墓峭诵行约膊?，而軟骨?xì)胞自噬水平降低是軟骨退變的主要原因[1-2]。維持軟骨細(xì)胞一定的自噬水平可減緩軟骨退變，是軟骨細(xì)胞生存的重要方式[1-2]。目前中醫(yī)藥治療KOA已受到廣泛關(guān)注[3-4]。補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊臨床運(yùn)用逾18 a，臨床報(bào)道和實(shí)驗(yàn)研究均表明其對(duì)KOA具有一定的療效[5-10]。本研究擬以KOA大鼠為研究對(duì)象，從軟骨自噬角度探討補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊治療KOA的作用機(jī)制，為補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊臨床治療 KOA 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境：廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，設(shè)施使用許可證號(hào)為SYXK(粵)2015-0059。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑

補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊(批準(zhǔn)文號(hào)為粵藥制字Z20071352，批號(hào)為20180801，藥物組成：杜仲、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、熟地黃、血竭、全蝎等)由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供；木瓜蛋白酶(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為SLBR9817V)；半胱氨酸(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)為BCBN4306V)；大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為370180831，569181010)；4%組織細(xì)胞固定液(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)為893001335)；Trigol試劑(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)為99G00127)；RevertAid Reverse Transcriptase(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)為00366374)；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)AHX0051N)；ddH2O(北京天根生化科技有限公司，批號(hào)R6305)；蘇木精-伊紅(HE)染液(廣州優(yōu)迪生物科技有限公司，批號(hào)為0314A20)；番紅染液和固綠染液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為1205A14)；RIPA蛋白裂解液和蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物(上海貝博生物公司，批號(hào)為BB18091)；BCA蛋白定量分析試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)為SE248351)；Super Signal?West Pico Chemiluminescent Substrate(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)為QE217005)；β-actin抗體(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)為00047970)；MMP13抗體(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)為00018170)；Beclin1抗體(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)為00018170)；LC3B(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)為GR319117-2)；ULK1(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)為00070905)；p-AMPK(T172)(美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)為14)；p-mTOR(Ser2448)(美國(guó)Affinity Biosciences公司，批號(hào)為55y1643)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)為20000199)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

BX51熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；BSA224S電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；全配置病理分析儀器(德國(guó)Leica公司)；5424型小型高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；702型-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Smart Spec Plus核酸蛋白測(cè)定儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；IQTM5熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Tanon 5200 Multi多功能成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1KOA模型 大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射木瓜蛋白酶和半胱氨酸，注射劑量為每個(gè)膝關(guān)節(jié)腔50 μL，注射時(shí)間為第1、3、7天，4周后KOA造模成功。

1.4.2動(dòng)物分組 40只SD大鼠按隨機(jī)分組數(shù)字表法分為正常組、模型組、補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組，每組10只。除正常組外，其余三組大鼠復(fù)制KOA模型。

1.4.3動(dòng)物給藥和樣本采集 補(bǔ)腎高、低劑量組按照人推薦劑量進(jìn)行等效換算，分別給予0.486 g/kg及0.243 g/kg補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。給藥6周后，處死動(dòng)物，收集大鼠血清用于ELISA檢測(cè)；各組隨機(jī)取4只大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)組織，放置于4%組織細(xì)胞固定液中固定，用于HE染色和番紅-固綠染色以及改良Mankin評(píng)分；其余大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織保存于-80 ℃冰箱中，留待實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)。

1.4.4組織病理學(xué)檢測(cè) 大鼠雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織固定72 h，脫鈣處理，石蠟包埋，切薄片，脫蠟，HE或番紅-固綠染色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，最后用中性樹脂封片。光鏡下觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理改變情況，并進(jìn)行改良Mankin評(píng)分定量評(píng)估軟骨損傷情況。

1.4.5ELISA檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書要求，使用多功能酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品各孔的吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作為橫坐標(biāo)，各孔檢測(cè)的吸光度值作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算各組大鼠血清樣品IL-1β和TNF-α水平。

1.4.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 從冰箱中取出凍存的大鼠軟骨組織剪碎，液氮研磨至細(xì)顆粒狀，采用Trigol裂解并加入氯仿震蕩后離心，取最上層上清液，加入等體積的異丙醇，充分混勻靜置30 min后離心，棄上清。加入75%乙醇沖洗沉淀，離心棄上清，離心管開蓋靜置，待殘留的乙醇完全揮發(fā)，沉淀變?yōu)闊o(wú)色凝膠狀時(shí)加入ddH2O溶解，即為總RNA?？俁NA濃度和純度采用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定。總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA。將ddH2O 9.5 μL，相關(guān)前引物F和后引物R(終濃度均是1 μmol/L)各1 μL，cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) 12.5 μL混合后共25 μL體系放入定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)完成后分析產(chǎn)物熔解曲線。以18S作為內(nèi)參，采用2-△△Ct的方法計(jì)算各組基因相對(duì)表達(dá)量。所有引物均由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 相關(guān)基因的引物信息

1.4.7Western Blot檢測(cè) 從冰箱中取出凍存的大鼠軟骨組織剪碎，液氮研磨至細(xì)顆粒狀，加入PIPA蛋白裂解液與蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物處理后，震蕩，離心，取上清。采用BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳及電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，用8%牛奶封閉膜1.5 h，加入蛋白一抗抗體 4 ℃過(guò)夜，第二天回收一抗抗體，Western洗滌液洗4次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG孵育膜1.5 h，Western洗滌液洗4次。將膜置于顯影液中反應(yīng)1 min，在成像系統(tǒng)中進(jìn)行發(fā)光顯影、拍照，最后采用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊對(duì)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨病理變化的影響

正常組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，無(wú)裂隙，軟骨細(xì)胞排列規(guī)則，大小均勻，層次分明，基質(zhì)染色正常，有完整的潮線存在；模型組大鼠軟骨表面粗糙，軟骨層變薄，有不規(guī)則裂隙，細(xì)胞數(shù)明顯減少，基質(zhì)染色減少，潮線大量破壞；補(bǔ)腎高劑量組和低劑量組大鼠軟骨表面基本光滑，偶有裂隙，細(xì)胞數(shù)有所減少，基質(zhì)染色輕度減退，細(xì)胞排列相對(duì)整齊，潮線有所殘缺(見圖1-圖2)。改良Mankin評(píng)分結(jié)果表明與正常組相比，模型組Mankin評(píng)分顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；補(bǔ)腎高劑量組和低劑量組Mankin評(píng)分顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨HE染色(×200)

圖2 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨番紅-固綠染色(×100)

圖3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評(píng)分

2.2 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊對(duì)KOA大鼠血清IL-1β和TNF-α水平的影響

如圖4所示，與正常組相比，模型組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，補(bǔ)腎高劑量組和低劑量組IL-1β和TNF-α水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊對(duì)KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨MMP13、Beclin1、LC3B、ULK1 mRNA表達(dá)的影響

圖4 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α的水平

如圖5所示，與正常組相比，模型組MMP13 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Beclin1、LC3B、ULK1 mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，補(bǔ)腎高劑量組和低劑量組MMP13 mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Beclin1、LC3B、ULK1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖5 各組大鼠軟骨相關(guān)mRNA的相對(duì)表達(dá)

2.4 補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊對(duì)KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨MMP13、Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ULK1、p-AMPK、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

如圖6所示，與正常組相比，模型組MMP13和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、p-AMPK、ULK1 蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，補(bǔ)腎高劑量組和低劑量組MMP13和p-mTOR蛋白表達(dá)水平顯著降低，Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ、ULK1蛋白表達(dá)水平顯著升高，補(bǔ)腎高劑量組p-AMPK蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖6 各組大鼠軟骨相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)

3 討論

KOA的臨床表現(xiàn)主要以膝關(guān)節(jié)進(jìn)行性疼痛、關(guān)節(jié)不穩(wěn)定為特征，屬于中醫(yī)“骨痹”范疇，《素問(wèn)·長(zhǎng)刺論》中記載：“骨痹病，其病在于腎。骨重而不可舉，骨髓可見酸痛癥狀，故名曰骨痹?！逼洳C(jī)特點(diǎn)多為“腎虛血瘀”“腎虛絡(luò)阻”，當(dāng)以“補(bǔ)腎活血法”治療。廣東省第二中醫(yī)院院內(nèi)制劑補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊以杜仲、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、熟地黃四藥補(bǔ)肝腎共為君藥，血竭活血通絡(luò)為臣藥，全蝎祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛為佐藥，六藥合用具有強(qiáng)筋壯骨、活血通絡(luò)之功效。前期的臨床報(bào)道和實(shí)驗(yàn)研究表明其治療KOA療效良好[5-10]，但其作用機(jī)制還未闡明。

本研究通過(guò)關(guān)節(jié)腔注射木瓜蛋白酶復(fù)制KOA大鼠模型，6周后染色結(jié)果顯示模型組大鼠軟骨關(guān)節(jié)面不平整，關(guān)節(jié)軟骨大面積消失，細(xì)胞數(shù)明顯減少，介于正常關(guān)節(jié)軟骨和鈣化軟骨之間的潮線結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，其Mankin評(píng)分也明顯高于正常組。經(jīng)補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊高、低劑量治療后，KOA大鼠的軟骨結(jié)構(gòu)更為完整，軟骨表面形態(tài)受損較輕，Mankin評(píng)分也明顯降低。病理觀察的結(jié)果表明補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊明顯改善了KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨病變程度。KOA發(fā)病過(guò)程伴隨著促炎因子表達(dá)的增加[11]，軟骨細(xì)胞分泌的促炎因子IL-1β和TNF-α可以增加MMP13的表達(dá)，從而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解加劇，促進(jìn)軟骨退變[12-13]。研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊降低了促炎因子IL-1β和TNF-α的水平，并且通過(guò)抑制MMP13表達(dá)減緩了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分解代謝。

另一方面，這些促炎因子也具有抑制細(xì)胞自噬水平的作用[14]。細(xì)胞自噬是真核生物中一種進(jìn)化保守的溶酶體降解途徑，軟骨細(xì)胞自噬可以為軟骨細(xì)胞的再生、修復(fù)提供原料，維持軟骨細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[15]。自噬體的形成是自噬過(guò)程的必要條件。哺乳動(dòng)物的自噬關(guān)鍵基因包括ULK1、Beclin1和LC3B。ULK1處于自噬信號(hào)通路中最上游的位置，被認(rèn)為是自噬的主要調(diào)控因子，在細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用，招募其他 Atg 蛋白形成自噬體[16]。ULK1激酶失活則會(huì)抑制自噬發(fā)生。Beclin1是自噬重要的正向調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)與自噬水平呈正相關(guān)，參與調(diào)控自噬體的形成和成熟[17]。LC3B為自噬過(guò)程中重要的蛋白分子，并且是自噬標(biāo)志物，有LC3B-Ⅰ 和LC3B-Ⅱ兩種存在形式，主要參與自噬體的形成[18]。自噬發(fā)生時(shí)，LC3B-Ⅰ會(huì)轉(zhuǎn)化成LC3B-Ⅱ，因此LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)量比值可以用來(lái)評(píng)估細(xì)胞自噬水平。在KOA發(fā)病過(guò)程中，由于軟骨細(xì)胞正常的自噬水平受到促炎因子的抑制，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞內(nèi)功能紊亂和受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)等有害物質(zhì)無(wú)法及時(shí)清除，破壞了軟骨細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，從而加劇了關(guān)節(jié)軟骨退變[19]。

已有研究表明藥物抑制mTOR以及軟骨特異性敲除mTOR都可以減輕小鼠KOA的病變程度，抑制mTOR信號(hào)通路導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的自噬增加，最終起到緩解KOA的作用[14，20]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是細(xì)胞主要的能量感受器[21]，AMPK相關(guān)基因敲除后可加重小鼠KOA的病變程度[22]。并且有研究表明 AMPK信號(hào)通路也參與了KOA的軟骨代謝過(guò)程，在KOA患者的軟骨組織和IL-1或TNF-α處理的人軟骨細(xì)胞中均觀察到AMPK活性的降低[23]。活化的 AMPK能夠抑制mTOR的活性，導(dǎo)致mTOR對(duì)ULK1的抑制作用減弱，ULK1表達(dá)增強(qiáng)，提高細(xì)胞自噬水平。當(dāng)前，廣大研究者開始關(guān)注AMPK/mTOR通路在軟骨細(xì)胞自噬中扮演的角色。

本研究中關(guān)于軟骨細(xì)胞自噬的結(jié)果和Li等報(bào)道的結(jié)果一致[24]，實(shí)驗(yàn)中復(fù)制的木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的KOA模型大鼠軟骨自噬相關(guān)ULK1、Beclin1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)均明顯下降，表明在此KOA模型下存在促炎因子引起的細(xì)胞自噬水平下降。研究還發(fā)現(xiàn)p-AMPK蛋白表達(dá)明顯降低，p-mTOR蛋白表達(dá)明顯上升，表明當(dāng)前KOA大鼠軟骨自噬水平降低的狀態(tài)與AMPK/mTOR通路有關(guān)。補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊顯著提高了p-AMPK蛋白表達(dá)水平，降低了p-mTOR蛋白表達(dá)水平，表明AMPK活性增強(qiáng)，mTOR活性減弱，mTOR信號(hào)通路受到抑制。在此情況下，補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊顯著提高了ULK1和Beclin1基因和蛋白表達(dá)，并且顯著提高了LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值，充分說(shuō)明其激活了軟骨細(xì)胞自噬。

綜上所述，本研究表明補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊通過(guò)AMPK/mTOR通路調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞自噬是其有效治療KOA的機(jī)制之一。然而補(bǔ)腎強(qiáng)筋膠囊是否通過(guò)其他信號(hào)通路調(diào)控自噬以及該方中調(diào)控自噬有效成分的確認(rèn)還有待進(jìn)一步研究。