華可心 于淑穎,2 徐英春

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科 侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,北京 100730)

白念珠菌是一種機(jī)會(huì)性致病真菌，也是引起真菌血癥和播散性念珠菌病的主要病原體[1]。白念珠菌定植于人體的皮膚和黏膜等部位，當(dāng)機(jī)體的正常防御功能受損時(shí)，如創(chuàng)傷、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)、免疫功能缺陷、激素和抗生素的應(yīng)用導(dǎo)致菌群失調(diào)等[2]，白念珠菌會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)，從口腔、咽喉和生殖道等淺表黏膜感染轉(zhuǎn)變?yōu)檠h(huán)系統(tǒng)、骨骼和大腦的全身性侵襲性念珠菌病[3]。白念珠菌常以生物被膜的形式生長(zhǎng)在植入體內(nèi)的生物材料上，比如中心靜脈導(dǎo)管、導(dǎo)尿管、心臟起搏器和其他與器官直接接觸的材料。白念珠菌的生物被膜能有效地抵御機(jī)體免疫力和抗真菌藥物，誘導(dǎo)白念珠菌耐藥性的增加，從而導(dǎo)致臨床治療困難。本文綜述了白念珠菌生物被膜的形成、耐藥機(jī)制及其相關(guān)感染治療方法的研究進(jìn)展。

1 白念珠菌生物被膜

白念珠菌生物被膜是由絲狀細(xì)胞和酵母細(xì)胞組成、細(xì)胞外基質(zhì)包被的復(fù)雜生物群落，細(xì)胞外基質(zhì)增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖能力和對(duì)抗真菌藥物的耐藥性。在全球范圍內(nèi)，白念珠菌生物被膜的感染主要導(dǎo)致醫(yī)用生物材料相關(guān)性念珠菌病，具有很高的死亡率和發(fā)病率[4]。臨床醫(yī)生在治療侵襲性念珠菌病過(guò)程中遇到的主要問(wèn)題，是白念珠菌生物被膜會(huì)在使用強(qiáng)抗真菌藥物時(shí)顯示出耐藥性，導(dǎo)致治療無(wú)法進(jìn)行。此外，白念珠菌基因組的可塑性使其具有微進(jìn)化和宿主適應(yīng)性等優(yōu)勢(shì)[5]。因此，白念珠菌生物被膜的形成過(guò)程和耐藥機(jī)制等研究，對(duì)于研發(fā)新型抗真菌藥物的和探索非傳統(tǒng)抗真菌藥物對(duì)白念珠菌生物被膜的療效至關(guān)重要。

2 白念珠菌生物被膜的形成過(guò)程

白念珠菌生物被膜是由細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)包裹酵母細(xì)胞、菌絲細(xì)胞和假菌絲細(xì)胞組成的致密的網(wǎng)狀系統(tǒng)，呈有機(jī)的三維結(jié)構(gòu)和廣泛的空間不均一性，ECM具有保護(hù)作用[6]。生物被膜相關(guān)感染，治療非常困難，臨床上分離的白念珠菌生物被膜的毒力更強(qiáng)，增加了患者的死亡率[7,8]。

在白念珠菌生物被膜的形成過(guò)程中，可分為4個(gè)階段:①黏附；②起始(也稱增殖)；③成熟；④分散。通常在24～48 h內(nèi)按順序進(jìn)行[6,9]。10個(gè)早期黏附相關(guān)基因中，ALS1、ALS2、ALS3、EAP1和MSB2基因已被證明是生物被膜形成的必要基因[10]。在黏附過(guò)程中，單個(gè)酵母細(xì)胞黏附在物體表面，啟動(dòng)生物被膜形成階段。此時(shí)的酵母細(xì)胞還可以重新回到浮游狀態(tài)，所以在這個(gè)階段，生物被膜的形成是可逆的。在起始階段，酵母菌繁殖形成微菌落，微菌落融合構(gòu)成生物被膜的基底層，分裂的酵母細(xì)胞開(kāi)始形成假菌絲和菌絲細(xì)胞，并在整個(gè)生物被膜形成過(guò)程中繼續(xù)伸長(zhǎng)和增殖，侵入宿主或植入的生物材料表面[11]。形成生物被膜的核心調(diào)控因子，例如Efg1、Ndt80、Rob1和Tec1也參與調(diào)控浮游細(xì)胞的菌絲生長(zhǎng)，上述任何的基因缺失都可以減少甚至消除菌絲的形成。在生物被膜成熟過(guò)程中，菌絲是白念珠菌生物被膜發(fā)育的支架，支撐著生物被膜的不同組成部分，有助于生物被膜整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。臨床分離株的轉(zhuǎn)錄譜研究表明，與形成較薄生物被膜的菌株相比，較厚生物被膜的菌株具有HWP1等菌絲特殊基因的高表達(dá)[12]。隨著菌絲的產(chǎn)生，多糖會(huì)不斷分泌ECM。白念珠菌生物被膜的ECM是復(fù)雜的。多糖主要包括甘露聚糖、β-1,6葡聚糖和β-1,3葡聚糖[13]。盡管β-1,3葡聚糖是次要成分，但它與生物被膜的耐藥性有關(guān)，并阻止藥物擴(kuò)散[14]。在擴(kuò)散階段，單個(gè)酵母細(xì)胞從成熟生物被膜的菌絲中釋放出來(lái)，重新變成浮游狀態(tài)，然后繼續(xù)傳播到其他宿主，開(kāi)始1個(gè)新的生物被膜形成周期，從而造成傳播感染。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Ume6、Nrg1和Pes1(也稱為Nop7)都與擴(kuò)散有關(guān)，NRG1或PES1的過(guò)表達(dá)增加了生物被膜釋放的細(xì)胞數(shù)量，而Ume6的過(guò)表達(dá)可以減少擴(kuò)散[15,16]。

3 白念珠菌生物被膜的耐藥機(jī)制

對(duì)于白念珠菌的治療目前有四類主要的抗真菌藥物被用于治療大多數(shù)真菌感染:唑類、多烯類、棘白菌素和嘧啶類。而白念珠菌的生物膜對(duì)大多數(shù)已知的抗真菌藥物，具有固有的耐藥性如唑類和多烯類對(duì)白念珠菌的生物膜無(wú)效。白念珠菌生物被膜耐藥性是多種因素和機(jī)制共同作用的結(jié)果，目前對(duì)生物被膜耐藥機(jī)制的研究主要有以下3個(gè)方面：

3.1 外排泵

白念珠菌介導(dǎo)藥物流出的主動(dòng)外排系統(tǒng)有兩大類：ATP結(jié)合盒超家族(ATP binding cassette, ABC)和主要易化子超家族(the major facilitator, MFS)。前者與耐藥相關(guān)的基因主要是CDR1與CDR2編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而后者主要是由MDRl基因編碼的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過(guò)膜中H+的交換來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)底物，屬非能量依賴型載體。在浮游細(xì)胞中，外排泵通常在抗真菌藥物的作用下上調(diào)，然而在生物被膜中，即使在沒(méi)有抗真菌藥物的情況下，它們?cè)陴じ降淖畛鯉讉€(gè)小時(shí)內(nèi)上調(diào)，并在整個(gè)生物膜發(fā)育過(guò)程中保持上調(diào)。SHI等[17]通過(guò)臨床分離了23株白念珠菌分離株，采用結(jié)晶紫分析法監(jiān)測(cè)生物膜的生長(zhǎng)，運(yùn)用RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)體相關(guān)基因MDR1、CDR1、CDR2以及ERG11(編碼抗真菌藥物靶向酶的基因)的表達(dá)的進(jìn)行量化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氟康唑可以在早期誘導(dǎo)外排泵編碼基因在生物膜形成中的過(guò)度表達(dá)。雖然在生物膜和浮游細(xì)胞中加入氟康唑后，ERG11在生物膜中沒(méi)有上調(diào)，但ERG11出現(xiàn)過(guò)表達(dá)。外排泵編碼基因的上調(diào)表明了它們?cè)诎啄钪榫锬ば纬稍缙趯?duì)氟康唑耐藥性的形成過(guò)程中發(fā)揮的作用。TAC1為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)鍵調(diào)控因子，TACl基因GOF突變可導(dǎo)致生物被膜耐藥外排泵相關(guān)的基因CDR1、CDR2過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致白念珠菌細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出細(xì)胞外，從而達(dá)不到藥效濃度[18]。

3.2 細(xì)胞外基質(zhì)

基質(zhì)既是生物膜整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定劑,又是藥物穿透的物理屏障。生物膜耐藥的主要決定因素之一是細(xì)胞外基質(zhì)中的甘露聚糖-葡聚糖復(fù)合物[19]。細(xì)胞外基質(zhì)中的β-1,3葡聚糖與生物被膜的耐藥性有關(guān)，Tan等在研究中，通過(guò)評(píng)價(jià)了β-1,3-葡聚糖酶的抗生物膜活性，發(fā)現(xiàn)β-1,3-葡聚糖酶可以降解白念珠菌生物膜中的β-1,3-葡聚糖。生物膜的分散率為55.96%。β-1,3-葡聚糖酶對(duì)浮游念珠菌的生長(zhǎng)和黏附?jīng)]有影響，β-1,3-葡聚糖可以明顯增強(qiáng)了氟康唑和兩性霉素B的抗真菌藥敏性。激光共聚焦掃描顯微鏡和掃描電鏡檢查證實(shí)了β-1,3-葡聚糖酶的抗生物膜活性。研究結(jié)果表明，特異性靶向或酶法降解生物膜基質(zhì)可能是對(duì)抗白念珠菌生物膜的有效新療法[14]。

3.3 持留細(xì)胞

持留細(xì)胞是導(dǎo)致白念珠菌生物膜耐藥的另一因素，持留細(xì)胞是真菌生物膜內(nèi)的小亞群，對(duì)高濃度的抗真菌物質(zhì)有抗性。當(dāng)在生物膜內(nèi)出現(xiàn)表型變異，對(duì)抗真菌藥物具有極強(qiáng)的耐藥性。持留細(xì)胞存在休眠狀態(tài)，可以幫助它對(duì)抗兩性霉素B[20]。雖然對(duì)白念珠菌生物膜中持留細(xì)胞的形成和發(fā)育了解的很少，但我們知道持留細(xì)胞的耐藥性與細(xì)胞膜的成分和射流泵基因表達(dá)存在區(qū)別,是細(xì)胞的新陳代謝休眠狀態(tài)的結(jié)果。持留細(xì)胞如何機(jī)械性調(diào)控的作用機(jī)制，可能是未來(lái)開(kāi)發(fā)新的治療方法來(lái)阻止它們形成或存活的關(guān)鍵。[21]

4 抗白念珠菌生物被膜的藥物的研究進(jìn)展

4.1 非抗真菌藥物與傳統(tǒng)真菌藥物聯(lián)合使用對(duì)抗白念珠菌生物被膜的研究進(jìn)展

2016年Li等[22]通過(guò)臨床分離的白念珠菌生物膜體外構(gòu)建生物膜模型，熒光染色法觀察生物膜的生長(zhǎng)和形態(tài)，XTT法測(cè)定藥物對(duì)生物膜型白念珠菌細(xì)胞活性的影響，RT-PCR的方法測(cè)定黏附基因ALS3、HWP1和外排泵基因CDR1和MDR及細(xì)胞壁相關(guān)基因ERG11的mRNA表達(dá)量的變化。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢菌素A能夠增強(qiáng)生物被膜型白念珠菌藥物對(duì)氟康唑的敏感性。2017年Li等[23]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸氨溴索可以通過(guò)抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，增加氟康唑的吸收并減少其外流。結(jié)果表明氟康唑和鹽酸氨溴索聯(lián)合使用對(duì)不同時(shí)期耐藥的白念珠菌生物被膜具有協(xié)同作用。鹽酸氨溴索和氟康唑在體內(nèi)外的聯(lián)合使用均使白念珠菌的耐藥性產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)。這兩種藥物的組合可能成為治療白念珠菌耐藥性的潛在治療方法。2020年Jhones等[24]研究表明ToAP2和NDBP-5.7肽對(duì)白念珠菌浮游生物膜和生物膜具有活性。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得出ToAP2肽與氟康唑和兩性霉素B的具有協(xié)同作用。

4.2 白念珠菌生物被膜新型物質(zhì)的研究進(jìn)展

白念珠菌生物被膜的形成常會(huì)危及生命很難根除。目前的抗真菌治療對(duì)生物被膜的形成影響很小，沒(méi)有有效的解決方案。隨著耐藥性的增強(qiáng)進(jìn)一步阻礙了抗真菌藥物的療效。近年來(lái)，一些體外實(shí)驗(yàn)提示有些藥物，可以成為治療白念珠菌生物被膜感染的有效手段。

多項(xiàng)研究表明地衣酸是苔蘚的次要代謝產(chǎn)物，可抑制不同細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，然而其抗菌作用機(jī)制仍不清楚。Mriana等[25]通過(guò)研究白念珠菌生物被膜中的細(xì)胞應(yīng)激和抗氧化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)地衣酸可以改變氧化-抗氧化平衡，可能是導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷和細(xì)胞死亡的原因。研究結(jié)果表明，地衣酸可以作為治療念珠菌感染的一種替代藥物，值得進(jìn)一步研究。

檞皮素(QCT)是指一種膳食類的黃酮，已被證明對(duì)白念珠菌生物被膜具有抑制作用。對(duì)于引起外陰陰道念珠菌病(VVC)的白念珠菌，其生物被膜是導(dǎo)致氟康唑(FCZ)耐藥的重要因素之一。Mei等[26]展開(kāi)了QCT和FCZ對(duì)白念珠菌生物被膜抑制作用的研究，在實(shí)驗(yàn)中，QCT和FCZ同時(shí)使用可以抑制VVC中生物被膜酵母向菌絲的轉(zhuǎn)化，顯示QCT具有與FCZ的協(xié)同作用和良好的抗真菌作用，可用于白念珠菌生物被膜致VVC的臨床治療中。

光動(dòng)力學(xué)滅活對(duì)氟康唑耐藥的白念珠菌生物被膜具有抑制作用。Lucia等[27]利用紅色激光照射被亞甲藍(lán)處理的對(duì)氟康唑耐藥的白念珠菌生物被膜進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)滅活(PDI)研究證明:① PDI對(duì)生物被膜有效；②復(fù)合菌絲形成的生物被膜與酵母菌形成的生物被膜在敏感性上存在差異，酵母菌形成的生物被膜更為敏感；③PDI對(duì)氟康唑耐藥菌株形成的生物被膜有效。

CHEN等[28]研究法尼醇通過(guò)調(diào)節(jié)環(huán)AMP(CAMP信號(hào)通路)抑制菌絲生長(zhǎng)，CYRI和PDE2調(diào)節(jié)一對(duì)直接負(fù)責(zé)CAMP合成和降解的酶。法尼醇對(duì)白念珠菌生物膜具有潛在的抗真菌活性。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明CYRI和PDE2可提高白念珠菌生物膜的抗真菌能力。法尼醇通過(guò)調(diào)控CYRI和PDE2基因的表達(dá)來(lái)抑制白念珠菌生物膜的抗真菌作用。

5 小 結(jié)

白念珠菌生物膜在臨床留置裝置上定植，是導(dǎo)致血源性感染的重要因素。由于白念珠菌生物被膜形成過(guò)程和耐藥機(jī)制的復(fù)雜性，且對(duì)許多傳統(tǒng)的抗真菌藥物天然耐藥，本文介紹非真菌藥物與真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用以及新型抗真菌藥物的研究進(jìn)展，為白念珠菌生物被膜引起的難治性院內(nèi)感染提供了新思路。