高海龍，王鎬鋒，趙耀，高巖，王權(quán)

①上海科技大學(xué) 免疫化學(xué)研究所，上海 201210；②上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

新型冠狀病毒肺炎疫情由新型冠狀病毒SARS-CoV-2引起，而SARS-CoV-2屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）[1]，是一類宿主范圍廣泛的單股正鏈RNA病毒。目前，已經(jīng)鑒定出7種感染人的冠狀病毒，而新型冠狀病毒SARS-CoV-2與2003年間流行的SARS冠狀病毒在基因組序列上的相似性最高；同時(shí)，兩種病毒使用相同的宿主細(xì)胞表面受體（血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2，ACE2）進(jìn)入細(xì)胞，引起呼吸道癥狀，可能發(fā)展為嚴(yán)重肺炎并引起患者死亡[2]。此外，與SARS冠狀病毒相比，SARS-CoV-2具有更低的致死率，大多數(shù)感染者癥狀輕微，并且還有許多無(wú)癥狀感染病例出現(xiàn)。這些特性使得SARSCoV-2具有更高的傳播率，人際傳播更為迅速，從而引起大流行。

新冠病毒的復(fù)制增殖由其基因組中的開放閱讀框1a （ORF1a）和開放閱讀框1ab （ORF1ab）編碼的多種非結(jié)構(gòu)蛋白（nsps）負(fù)責(zé)，這些蛋白最初翻譯為多蛋白，然后進(jìn)行蛋白酶切割以及成熟。其中，主蛋白酶（Main protease,Mpro）切割產(chǎn)生非結(jié)構(gòu)蛋白nsp4～nsp16，促使各種非結(jié)構(gòu)蛋白的水解成熟。切割后蛋白質(zhì)根據(jù)功能特點(diǎn)，分別行使病毒增殖過程中相應(yīng)功能，轉(zhuǎn)錄復(fù)制相關(guān)蛋白會(huì)自組裝成轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體（replication and transcription complex,RTC），催化病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過程。其中，非結(jié)構(gòu)蛋白12 （nsp12）是具有RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）活性的核心催化亞基。單獨(dú)nsp12的聚合酶反應(yīng)效率很低，而輔因子nsp7、nsp8的存在會(huì)明顯促進(jìn)nsp12的聚合酶活性[3]。因此，研究人員將nsp12-nsp7-nsp8復(fù)合體定義為催化冠狀病毒RNA合成的最小核心單元。在基因組完整轉(zhuǎn)錄與復(fù)制過程中，還需要其他非結(jié)構(gòu)蛋白參與組裝完整的轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體，如nsp9、nsp10、nsp13、nsp14、nsp16等。更高層級(jí)的復(fù)合物狀態(tài)及其發(fā)揮功能的機(jī)理尚不清楚，需要進(jìn)一步結(jié)構(gòu)生物學(xué)證據(jù)闡明。由于宿主的免疫選擇，病毒的表面抗原蛋白易于發(fā)生突變，與之相比，病毒蛋白酶和聚合酶發(fā)生突變的概率較小，并且具有更高的進(jìn)化穩(wěn)定性，顯示出作為廣譜抗病毒藥物靶標(biāo)的巨大前景。全球科學(xué)家致力于尋找潛在的藥物以治療新冠患者，Mpro和RdRP由于在病毒生命周期中發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是新冠病毒藥物開發(fā)的兩大重要靶點(diǎn)。因此，了解SARS-CoV-2主蛋白酶和聚合酶復(fù)合物的結(jié)構(gòu)和功能是開發(fā)新型治療藥物的必要前提。

隨著疫情擴(kuò)大，我國(guó)科研工作者積極響應(yīng)國(guó)家需要，迅速投入到阻擊疫情的科研第一線。各研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)研究了新冠病毒侵染增殖過程，解析了關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)主蛋白酶Mpro和轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體多個(gè)狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)，闡明了病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的功能機(jī)制，同時(shí)為發(fā)展高效抗病毒藥物提供了關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，先后在《自然》（Nature）、《科學(xué)》（Science）、《細(xì)胞》（Cell）等國(guó)際期刊上發(fā)表系列研究論文，為國(guó)際抗新冠病毒藥物的研究做出了重要貢獻(xiàn)。

1 新冠病毒主蛋白酶Mpro的靶向藥物開發(fā)

疫情暴發(fā)伊始，上?？萍即髮W(xué)免疫化學(xué)研究所楊海濤研究員、饒子和院士團(tuán)隊(duì)，與中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所蔣華良院士團(tuán)隊(duì)等組成的新冠病毒應(yīng)急攻關(guān)團(tuán)隊(duì)，基于實(shí)驗(yàn)室早年在抗SARS病毒藥物研究上積累的經(jīng)驗(yàn)，開展新冠病毒結(jié)構(gòu)生物學(xué)及抗病毒藥物研究。攻關(guān)團(tuán)隊(duì)在獲得主蛋白酶基因序列信息后，快速表達(dá)純化了新冠病毒主蛋白酶Mpro并解析了其高分辨率晶體結(jié)構(gòu)。

2020年1月26日，研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上率先公布新冠病毒Mpro的三維結(jié)構(gòu)原子坐標(biāo)。隨后向國(guó)內(nèi)外300多家高等院校、科研院所以及藥物研發(fā)企業(yè)分享首個(gè)新冠病毒蛋白三維結(jié)構(gòu)信息，2月5日由國(guó)際蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank,PDB）公開發(fā)布。同時(shí)，該結(jié)構(gòu)也被評(píng)為2020年2月國(guó)際蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)的“明星分子”。

2020年4月9日，該項(xiàng)成果受邀在Nature雜志在線發(fā)表[4]。文章詳細(xì)描述了新冠病毒主蛋白酶的三維空間結(jié)構(gòu)，并基于該結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物篩選，通過分子、細(xì)胞藥效實(shí)驗(yàn)評(píng)估候選藥物的酶活抑制效果，發(fā)現(xiàn)數(shù)個(gè)具有較強(qiáng)病毒抑制作用的小分子。首先，攻關(guān)團(tuán)隊(duì)表達(dá)純化了分子量約為33.8 kDa的Mpro蛋白，并利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（FRET）對(duì)蛋白活性進(jìn)行了分析，通過計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)，結(jié)合體外酶活抑制實(shí)驗(yàn)分析了候選分子N3可能是Mpro蛋白的不可逆抑制劑。隨后，攻關(guān)團(tuán)隊(duì)制備了主蛋白酶和N3的復(fù)合物晶體，利用上海同步輻射光源大科學(xué)裝置收集了晶體衍射數(shù)據(jù)，并很快解析了復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。接下來(lái)，研究團(tuán)隊(duì)通過高通量篩選技術(shù)和基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選技術(shù)，成功篩選到7種潛在的候選藥物，其中雙硫侖（Disulfiram）和卡莫氟（Carmofur）是FDA已批準(zhǔn)上市的藥物，研究團(tuán)隊(duì)分析了多種藥物與Mpro的結(jié)合方式和成藥潛力。最后利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)估了藥物的抗病毒效果，其中Ebselen和N3表現(xiàn)出較強(qiáng)的病毒抑制作用。

該工作詳細(xì)地闡釋了新冠病毒Mpro蛋白與小分子抑制劑N3的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，綜合利用三種不同的藥物發(fā)現(xiàn)策略篩選了一批潛在藥物，并結(jié)合體外酶活實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞水平的抗病毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了部分藥物的抗病毒效果。這些研究成果將助力人們對(duì)于新冠病毒的認(rèn)知，也將推動(dòng)未來(lái)抗新冠病毒的臨床藥物研發(fā)。

2 新冠病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能機(jī)制

2.1 新冠病毒RdRP復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)

RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP，又稱nsp12）負(fù)責(zé)病毒RNA的合成，是冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的核心元件，同時(shí)也是抗病毒藥物瑞德西韋（Remdesivir）、法匹拉韋（Favipiravir）等的主要靶點(diǎn)。病毒的RNA聚合酶nsp12與輔因子nsp7和nsp8組成了轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)器的核心單元。

2020年4月10日，饒子和院士領(lǐng)導(dǎo)新冠病毒攻關(guān)小組報(bào)道了新冠病毒全長(zhǎng)nsp12與輔因子nsp7和nsp8復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，分辨率為2.9 ? （PDB ID:6M71）[5]。

新冠病毒的聚合酶nsp12包含一個(gè)經(jīng)典的“右手”聚合酶結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)套式病毒目特有的核苷酸轉(zhuǎn)移酶（NiRAN）結(jié)構(gòu)域[6]。其中，聚合酶結(jié)構(gòu)域可細(xì)分為手指、手掌、拇指三個(gè)亞結(jié)構(gòu)域，與經(jīng)典的病毒聚合酶結(jié)構(gòu)域排布相同[7]。在結(jié)構(gòu)中，研究者們首次定位了β-hairpin結(jié)構(gòu)域，插入在NiRAN和手掌亞結(jié)構(gòu)域形成的溝槽內(nèi)，維持了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。此前研究中報(bào)道提示瑞德西韋、法匹拉韋等核苷類化合物是潛在的抗冠狀病毒藥物，研究者分析了三磷酸形式瑞德西韋與復(fù)制酶復(fù)合物的可能結(jié)合方式，為闡明藥物小分子和聚合酶藥物靶點(diǎn)的結(jié)合模式提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。2020年5月30日，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所施一研究組發(fā)表研究論文[8]，描述了新型冠狀病毒聚合酶復(fù)合物（nsp12-nsp7-nsp8）結(jié)構(gòu)，并通過一系列生化實(shí)驗(yàn)揭示，SARS-CoV-2聚合酶活性低于SARS-CoV，單個(gè)蛋白組分的熱穩(wěn)定性降低，為不同冠狀病毒的適應(yīng)性進(jìn)化提供了線索。

在藥物研發(fā)過程中，一種新藥的發(fā)現(xiàn)必然經(jīng)歷漫長(zhǎng)的研發(fā)過程，研發(fā)時(shí)間長(zhǎng)，投入產(chǎn)出比小。因此，尋找已上市藥物的新適應(yīng)癥成為極具吸引力的策略。在已上市藥物的原適應(yīng)癥之外開發(fā)藥物新靶點(diǎn)、新用途的過程就稱為“老藥新用”?！袄纤幮掠谩笔且环N快速高效的篩選策略，這些潛在藥物分子具有已經(jīng)證實(shí)的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及安全性評(píng)價(jià)，因此可以避免藥物研發(fā)前期漫長(zhǎng)而高昂的評(píng)價(jià)過程，從而降低研發(fā)成本，縮短研發(fā)時(shí)間。截至目前，針對(duì)新冠肺炎，已經(jīng)開展了多種成藥的臨床試驗(yàn)，其中瑞德西韋和法匹拉韋作為明星分子，最受人關(guān)注。

2.2 瑞德西韋抑制病毒RNA復(fù)制酶的“延遲終止”機(jī)制

瑞德西韋，是一類核苷類似物前體藥，在體內(nèi)代謝為具有生物活性的三磷酸形式瑞德西韋。它由吉利德公司研發(fā)，最早用于治療埃博拉病毒和馬爾堡病毒感染。

在了解新型冠狀病毒核心轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體結(jié)構(gòu)后，為闡述聚合酶催化機(jī)制以及瑞德西韋抑制機(jī)理，饒子和院士聯(lián)合團(tuán)隊(duì)解析了聚合酶與輔助因子、RNA及抗病毒候選藥物瑞德西韋復(fù)合體2.9 ?的三維結(jié)構(gòu)，揭示了新冠病毒聚合酶復(fù)合體發(fā)揮活性過程中“轉(zhuǎn)位前”和“轉(zhuǎn)位后”兩種不同生理狀態(tài)構(gòu)象特征[9]。

通過對(duì)解析結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，三磷酸活性形式的瑞德西韋分子經(jīng)由病毒聚合酶催化，成功“混入”了產(chǎn)物RNA中，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)位至上游產(chǎn)物，形成“轉(zhuǎn)位后”復(fù)合體。結(jié)合生化與結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)結(jié)果，驗(yàn)證了瑞德西韋能夠“混入”RNA產(chǎn)物并與上游產(chǎn)物退出通道中861位絲氨基酸產(chǎn)生強(qiáng)烈的位阻效應(yīng)，從而阻礙RNA合成繼續(xù)進(jìn)行，發(fā)揮其“延遲終止（delayed chaintermination）”的抑制效果。

目前對(duì)SARS冠狀病毒RNA聚合酶的活性研究顯示，nsp7和nsp8對(duì)RNA聚合酶介導(dǎo)的病毒新生RNA合成反應(yīng)至關(guān)重要，但其確切的生理功能尚不明晰。該研究捕捉到反應(yīng)進(jìn)入穩(wěn)定延伸階段后，新冠病毒RNA聚合酶復(fù)合物中兩個(gè)nsp8分子N端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象出現(xiàn)大幅度變化。兩個(gè)nsp8分子的N端部分相互靠攏，在產(chǎn)物RNA上游退出路徑中構(gòu)成一個(gè)結(jié)構(gòu)性平臺(tái)，對(duì)新生RNA轉(zhuǎn)位和快速行進(jìn)起到重要作用。至此，新冠病毒非結(jié)構(gòu)蛋白nsp7和nsp8作為RNA聚合酶復(fù)合物中必不可少的一部分，其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及生理意義得到充分闡述。文章引用了團(tuán)隊(duì)多年前在冠狀病毒nsp7/nsp8十六聚體引物酶方向的研究[10]，提出了引物酶復(fù)合體向聚合酶復(fù)合體過渡的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換模型，進(jìn)一步深入探究了新型冠狀病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制的分子機(jī)理，為靶向轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程的抗新冠肺炎藥物開發(fā)與設(shè)計(jì)開辟了新途徑。

與此同時(shí)，2020年5月1日，中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所徐華強(qiáng)研究團(tuán)隊(duì)解析了新冠病毒復(fù)制酶與瑞德西韋復(fù)合物結(jié)構(gòu)[11]。首先使用昆蟲表達(dá)體系共表達(dá)了新冠病毒的聚合酶三元復(fù)合物，通過凝膠遷移實(shí)驗(yàn)（EMSA）驗(yàn)證了聚合酶復(fù)合物與RNA的結(jié)合，三磷酸形式瑞德西韋可抑制聚合酶活性；同時(shí)，首次利用了體外生化實(shí)驗(yàn)，建立了新冠病毒復(fù)制酶活性的測(cè)定方法，并且通過三磷酸形式瑞德西韋和瑞德西韋設(shè)計(jì)和建立了藥物抑制試驗(yàn)，驗(yàn)證了三磷酸形式瑞德西韋是最終發(fā)揮活性的小分子形式。通過冷凍電鏡獲得了2.8 ?分辨率的apo復(fù)合物結(jié)構(gòu)和2.5 ?分辨率的復(fù)制酶/RNA/瑞德西韋復(fù)合物，兩個(gè)結(jié)構(gòu)總體上較為接近，在聚合酶結(jié)構(gòu)域中D618和S814參與了催化中心兩個(gè)鎂離子的配位。

2.3 法匹拉韋抑制新冠病毒機(jī)制

法匹拉韋，主要用于治療成人新型或再次流行的流感，其作用機(jī)制為在病毒基因組復(fù)制過程中，模仿嘌呤類核苷酸，摻入病毒子代基因組RNA中，誘導(dǎo)病毒子代遺傳物質(zhì)突變，進(jìn)而抑制病毒正常增殖。這一類抑制效果與瑞德西韋或其他引起病毒RNA合成鏈終止反應(yīng)的核苷類似物不同。

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所施一、齊建勛研究團(tuán)隊(duì)，解析了法匹拉韋與新冠聚合酶復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)[12]，揭示了法匹拉韋和嘧啶殘基之間獨(dú)特的堿基配對(duì)方式，描繪了法匹拉韋模仿嘌呤類核苷酸的分子形態(tài)，并與嘧啶類核苷酸相互作用的分子機(jī)制。

2.4 蘇拉明抑制新冠病毒RNA復(fù)制酶機(jī)制

在針對(duì)病毒RNA聚合酶的抑制劑開發(fā)過程中，根據(jù)抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用方式的區(qū)別，可將其分為核苷類抑制劑以及非核苷類抑制劑。核苷類抑制劑，如瑞德西韋、法匹拉韋等，通過細(xì)胞代謝為有活性的三磷酸形式藥物，進(jìn)而被聚合酶使用，水解為單磷酸形式藥物，并以單磷酸形式摻入子代鏈中，抑制病毒的正常復(fù)制過程。非核苷類抑制劑，可不需要體內(nèi)代謝為活性三磷酸形式，而是直接作用于病毒的聚合酶，影響病毒正常復(fù)制過程。非核苷類抑制劑的開發(fā)，可以有效規(guī)避核苷類藥物的細(xì)胞毒性，并與其他作用機(jī)制的藥物協(xié)同作用。

中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所徐華強(qiáng)研究團(tuán)隊(duì)在新型冠狀病毒非核苷類抑制劑開發(fā)研究中，通過新型冠狀病毒聚合酶活性篩選體系，在成藥庫(kù)中篩選活性化合物，發(fā)現(xiàn)一類老藥蘇拉明可以有效抑制新冠病毒RNA聚合酶活性，藥效優(yōu)于三磷酸形式瑞德西韋；同時(shí)，細(xì)胞水平上也顯示出較強(qiáng)的抗病毒活性。通過冷凍電鏡技術(shù)，解析了蘇拉明與新型冠狀病毒聚合酶的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，每個(gè)復(fù)合物含有兩個(gè)蘇拉明分子，分別位于模板鏈結(jié)合位點(diǎn)和引物鏈所在的催化活性中心[13]。蘇拉明帶強(qiáng)負(fù)電性，可有效抑制核酸與聚合酶結(jié)合，進(jìn)而抑制聚合酶活性。該研究發(fā)現(xiàn)并描述了非核苷類抑制劑對(duì)新型冠狀病毒聚合酶作用機(jī)制與結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，為靶向新型冠狀病毒聚合酶的抑制劑開發(fā)提供新的思路。

2.5 新冠病毒 RNA延伸與帽結(jié)構(gòu)合成中間狀態(tài)cap（-1）′-RTC的分子機(jī)制

在侵入宿主細(xì)胞后，新冠病毒開始了宿主內(nèi)的生命周期，病毒編碼的多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白可以通過組裝形成轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體，負(fù)責(zé)病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制與RNA的加帽過程。組裝形成轉(zhuǎn)錄復(fù)制機(jī)器的元件包括聚合酶、解旋酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等，對(duì)病毒生命周期有著重要意義，是關(guān)鍵的抗病毒藥物靶點(diǎn)。

饒子和院士研究團(tuán)隊(duì)通過核酸分子的優(yōu)化設(shè)計(jì)，摸索了復(fù)合物形成的合適構(gòu)建條件，成功組裝了新冠病毒延伸狀態(tài)下的轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合物（elongation replication and transcription complex,E-RTC），并解析了2.9 ?分辨率的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。該復(fù)合物由1個(gè)nsp12分子、1個(gè)nsp7分子、2個(gè)nsp8分子、2個(gè)nsp13分子及核酸鏈組裝而成，關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)信息解釋了解旋酶分子如何協(xié)同聚合酶完成轉(zhuǎn)錄復(fù)制和RNA合成過程中錯(cuò)配回溯的分子機(jī)制[14]。

轉(zhuǎn)錄完成后的新冠病毒產(chǎn)物RNA需要一個(gè)成熟加帽的過程，該帽結(jié)構(gòu)可以幫助病毒RNA在宿主核糖體中翻譯，并且逃避宿主先天免疫。新冠病毒中的帽結(jié)構(gòu)形成、加工和修飾主要可分為以下四個(gè)步驟：①在RNA 5'-三磷酸酶（RTPase）活性下將pppA-RNA轉(zhuǎn)變成ppA-RNA[cap（-2）]；②在鳥苷轉(zhuǎn)移酶（GTase）活性下轉(zhuǎn)化生成GpppA-RNA[cap（-1）]；③在N7-MTase酶活性下生成7MeGpppA-RNA[cap（0）]；④在2'-O-MTase活性下生成7MeGpppA2'OMe-RNA[cap（1）][15]。在冠狀病毒加帽過程的第二步，也就是鳥苷轉(zhuǎn)移酶GTase活性，究竟由哪個(gè)蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域完成，一直是未知的。為探討加帽過程的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)通過優(yōu)化設(shè)計(jì)，成功組裝了第二步過程后的中間過渡狀態(tài)，即cap（-1） '-RTC的轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體，并解析了該復(fù)合物在2.8 ?分辨率下的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[16]。在該復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，單鏈核酸結(jié)合蛋白nsp9結(jié)合在聚合酶nsp12的N端核苷轉(zhuǎn)移酶（NiRAN）結(jié)構(gòu)域上，使得整個(gè)加帽過程卡在第二步到第三步的過渡態(tài)上。接下來(lái)，團(tuán)隊(duì)通過生化實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了nsp12的NiRAN結(jié)構(gòu)域可以催化完成RNA加帽的第二步反應(yīng)，執(zhí)行鳥苷轉(zhuǎn)移酶（GTase）活性，該關(guān)鍵酶分子的確認(rèn)也使得NiRAN結(jié)構(gòu)域成為抗病毒研發(fā)的新靶點(diǎn)。

2.6 新冠病毒mRNA加帽及基因組復(fù)制矯正的分子機(jī)制

新型冠狀病毒含有目前已知最大的RNA病毒基因組，共約30 kb，這使得新冠病毒存在一種獨(dú)特的“復(fù)制矯正”機(jī)制，用來(lái)對(duì)轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中的錯(cuò)配核苷酸進(jìn)行切除校正，該過程由nsp14的核酸外切酶結(jié)構(gòu)域完成。這種“復(fù)制矯正”機(jī)制也使得新冠病毒在一定程度上可以逃避瑞德西韋等多種核苷類似物的抑制活性；另一方面，nsp14還具有mRNA加帽第三步——N7-MTase的生理活性[17]。這樣在生命周期中存在顯著差異的兩個(gè)過程如何在同一個(gè)蛋白中進(jìn)行協(xié)同，也是冠狀病毒結(jié)構(gòu)功能研究領(lǐng)域懸而未決的難題之一。

鑒于此，饒子和院士聯(lián)合攻關(guān)團(tuán)隊(duì)在前期研究工作的基礎(chǔ)上，成功解析了加帽過程的關(guān)鍵復(fù)合物cap（0）-RTC與執(zhí)行“復(fù)制矯正”功能的超級(jí)復(fù)合體冷凍電鏡結(jié)構(gòu)[18]。通過結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)nsp9發(fā)揮了類似“適配器”（adaptor）的效應(yīng)，通過蛋白-蛋白的相互作用，將nsp10和nsp14招募到新形成的復(fù)合物中，完成mRNA加帽的第三步反應(yīng)。另外，cap（0）-RTC可以形成同源二聚體，該二聚體中解旋酶nsp13可以發(fā)生顯著的構(gòu)象變化。這種構(gòu)象變化會(huì)引起核酸產(chǎn)物鏈回溯，將產(chǎn)物鏈3'末端拉扯到臨近一側(cè)的另一分子復(fù)合物中核酸外切酶活性中心，并對(duì)錯(cuò)配核苷酸進(jìn)行矯正。這種矯正機(jī)制被稱為“in trans backtracking”，與真核細(xì)胞RNA聚合酶Pol II類似，表明新冠病毒在進(jìn)化中的高等性。該研究成果不僅揭示了新型冠狀病毒復(fù)制矯正的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，更為開發(fā)阻礙病毒逃逸機(jī)制的抑制劑提供結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

3 總結(jié)與展望

面對(duì)新型冠狀病毒，我國(guó)科研工作者的豐富成果得益于國(guó)內(nèi)各研究團(tuán)隊(duì)在冠狀病毒主蛋白酶及轉(zhuǎn)錄復(fù)制領(lǐng)域中的長(zhǎng)期積累。其中，饒子和院士研究團(tuán)隊(duì)自2003年“非典”暴發(fā)以來(lái)，長(zhǎng)期堅(jiān)守在冠狀病毒研究領(lǐng)域，是國(guó)際冠狀病毒研究領(lǐng)域的領(lǐng)軍實(shí)驗(yàn)室之一。多年的堅(jiān)守和積累，為此次新冠疫情科技攻關(guān)奠定了關(guān)鍵基礎(chǔ)，同時(shí)電子顯微學(xué)的進(jìn)步以及我國(guó)基礎(chǔ)研究水平的提高，也成為一系列研究在短時(shí)間內(nèi)獲得突破的重要條件。未來(lái)一段時(shí)間，隨著工作的深入，針對(duì)主蛋白酶和聚合酶兩個(gè)核心抗病毒藥物靶標(biāo)的藥物發(fā)現(xiàn)工作對(duì)于應(yīng)對(duì)冠狀病毒的長(zhǎng)期威脅有重要意義，研究過程中發(fā)現(xiàn)的一批抑制劑分子和已經(jīng)陸續(xù)進(jìn)入臨床研究階段的候選藥物可能會(huì)為疫情的控制發(fā)揮重要作用。