楊雨桐 張卿碩 符韻林 孫 靜

1.廣西大學(xué)資源環(huán)境與材料學(xué)院 南寧 530004； 2.廣西大學(xué)林學(xué)院 南寧 530004)

色素是當代生產(chǎn)生活中的一種重要添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、個人護理和紡織等領(lǐng)域。按來源不同，色素可分為天然色素和人工合成色素兩大類，其中，人工合成色素多是從煤焦油等化工產(chǎn)品中提煉出來的，其種類多、色澤鮮艷、成本低廉、著色力強，但提煉過程中有可能混入砷、汞、苯胺等物質(zhì)； 天然色素是從動、植物中提取并經(jīng)加工獲得的，對人體較為安全，毒性較小或無毒，但由于其來源少、價格高、著色力差，使用并不廣泛。相比人工合成色素，天然色素除了生態(tài)友好、無毒無害等優(yōu)點外，還具有一定的保健功能。近年來，隨著科技的不斷發(fā)展和人們對健康重視程度的日趨提升，越來越多的天然色素走向工業(yè)化生產(chǎn)的道路，并被投放于市場。目前，文獻報道及應(yīng)用于生產(chǎn)的木本植物源色素多來自植物果實(果皮和種皮)、莖葉與樹皮，如從紅木(Bixaorellana)種皮中提取的胭脂樹橙色素(Alczaretal.， 2017)、板栗(Castaneamollissima)殼棕色素(Yaoetal.， 2012)、橘皮黃色素(Aravantinosetal.， 2010)，從紅花檵木(Loropetalumchinensevar.rubrum)葉中提取的紅色素(唐克華等， 2005)，從落葉松(Larixgmelinii)樹皮中提取的紅色素(Duetal.， 2005)等。一些木材心材由于多酚類物質(zhì)積累，顏色較深，因此也可從中提取色素(Blancaetal.， 2004； Gutiérrezetal.， 2014)，多酚類物質(zhì)具有多種生理活性，如抑菌(Youetal.， 2014)、抗氧化(Hongetal.， 2018)、抗腫瘤(Bierhausetal.， 1997)、預(yù)防心血管疾病(Palasuwanetal.， 2005)等。將木材心材小粒徑廢料(如鋸末刨花)中的多酚類物質(zhì)提取出來，用作色素應(yīng)用于生產(chǎn)生活，有著廣闊的市場前景和研究價值；但當前關(guān)于木材心材有色抽提物的研究多集中于木材變色、心材發(fā)色機制等方面，從心材中提取色素的研究較少。

巴里黃檀(Dalbergiabariensis)為豆科(Fabaceae)黃檀屬(Dalbergia)喬木，心材新切面呈紫紅褐或暗紅褐色，常帶黑褐或栗褐色細條紋，繼降香黃檀(D.odorifera)、交趾黃檀(D.cochinchinensis)和檀香紫檀(Pterocarpussantalinus)紅木“老三樣”資源枯竭后被大量應(yīng)用于高檔家具和工藝品制作中(翟東群等， 2014)，但由此產(chǎn)生的加工余料、刨花、鋸末等多被燃燒，其潛在價值完全被忽視。交趾黃檀、降香黃檀為同屬樹種，心材含有大量黃酮類物質(zhì)，具有抗菌防腐、防癌抗氧化、治療心血管疾病等保健作用(Palasuwanetal.， 2005； Choietal.， 2017)。郭麗冰等(2008)采用硅膠柱色譜分離、核磁鑒定等方式從降香黃檀的乙酸乙酯部位中分離鑒定出8種化合物，其中異甘草素、柚皮素、芒柄花素均被證明具有消炎、抗腫瘤的藥理活性(Jietal.， 2017； 季鵬等， 2015； Chulwonetal.， 2018)。劉榮華等(2015)采用相同方式從交趾黃檀中分離鑒定出14種異黃酮類成分，其中美迪紫檀素可通過激活棕色脂肪細胞中的蛋白激酶A促進脂肪分解(Imranetal.， 2018)，染料木黃酮具有誘導(dǎo)肝癌細胞死亡的活性(Lietal.， 2017)。但未見巴里黃檀心材成分鑒定及其利用的相關(guān)報道。

鑒于此，本研究以巴里黃檀木制品加工廢料(刨花)為試驗材料，從中提取色素，分離鑒定色素成分，探究色素的穩(wěn)定性和抗氧化性，以期為充分利用巴里黃檀資源提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，為同類紅木資源的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴里黃檀刨花采自廣西憑祥劉吉利紅木廠，經(jīng)廣西大學(xué)鑒定為巴里黃檀的心材部分。試劑主要包括甲酸、甲醇、無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯化鋇、氯化鈣、硫酸銅、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈉、氯化鐵、氯化鋁、重鉻酸鉀、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽、過硫酸鉀、Vc、氫氧化鈉、稀鹽酸、芒柄花黃素標準品(上海源葉生物科技有限公司)。高效液相色譜儀所用試劑為色譜純，其余均為國產(chǎn)分析純，水為蒸餾水和超純水。

1.2 研究方法

1.2.1 心材刨花預(yù)處理 撿除刨花中的雜質(zhì)，篩除灰塵，經(jīng)粉碎機粉碎后過60目篩，50 ℃真空干燥至恒重，密封避光保存。

1.2.2 色素提取工藝流程 巴里黃檀心材木粉→70%乙醇恒溫攪拌抽提→抽提液離心→減壓濃縮→加水混懸→石油醚萃取除雜→乙酸乙酯萃取→減壓濃縮→干燥→巴里黃檀心材色素。

1.2.3 心材色素成分檢測 使用超高效液相色譜(UltiMate3000液相色譜，Dionex公司)-串聯(lián)四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(Q Exactive四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀，Thermo公司)法(UPLC-Q-EXACTIVE-MS)對巴里黃檀心材色素成分進行分離鑒定。

超高效液相色譜(UPLC)條件： ACQUITY UPLCBEHC18色譜柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫30 ℃； 正離子(ESI +) 模式； 流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇。樣品梯度洗脫條件見表1。自動進樣器溫度4 ℃，進樣體積1 μL。

表1 樣品流動相梯度洗脫條件

高分辨質(zhì)譜(Q-EXACTIVE-MS)條件： 加熱型電噴霧(HESI)離子源； 溫度300 ℃； 正、負離子模式下噴霧電壓均為3.0 kV； 傳輸毛細管溫度320 ℃； 鞘氣壓206.85 kPa； 輔助氣壓68.95 kPa； 掃描模式為Full MS和Full MS/dd-MS2，質(zhì)量范圍100～500m/z； 一級、二級掃描分辨率分別為70 000和17 500。

分別配制濃度1、5、10、20、100、1 000 μg·L-1的芒柄花黃素、甲醇溶液，上樣，建立濃度標準曲線，計算溶液中芒柄花黃素的相對含量。

1.2.4 心材色素穩(wěn)定性測定 1) pH對色素穩(wěn)定性的影響 取20 mL色素溶液于比色管中，分14組分別加入1 mol·L-1鹽酸溶液、1 mol·L-1NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH至1～14，可見光區(qū)波長范圍內(nèi)掃描色素溶液并繪制曲線。

2) 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 采用蒸餾水分別配制0.1 mol·L-1BaCl2、CaCl2、CuSO4、KCl、MgCl2、NaCl、FeCl3、AlCl3、K2Cr2O7溶液，取1 mL金屬鹽溶液于20 mL色素溶液中，振搖均勻，可見光區(qū)波長范圍內(nèi)掃描色素溶液并繪制曲線。

3) 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 取20 mL色素溶液于刻度試管中，分別于60、70、80 ℃下加熱1、2、3、4、5 h，冷卻定容后測定溶液吸光度。

4) 紫外光照對色素穩(wěn)定性的影響 取40 mL色素溶液于盛液盒中，密封，置于加速老化試驗機內(nèi)，以464.44 lux紫外光持續(xù)照射，每隔1 h取樣1次，共6 h，避光冷卻后測定溶液吸光度。

1.2.5 心材色素抗氧化性測定 1) DPPH自由基清除率測定 采用無水乙醇配制0.2 mmol·L-1DPPH-乙醇溶液，精確量取3 mL溶液于具塞試管中，分別加入3 mL濃度為40、80、120、160、200 mg·L-1的色素溶液，振搖均勻，室溫下避光靜置30 min，于517 nm處測定溶液吸光度。采用與色素同濃度的Vc水溶液為陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Ai為不加樣品只加DPPH的吸光度；A為加樣品和DPPH的吸光度；A0為加樣品不加DPPH的吸光度。

2) ABTS自由基清除率測定 配制7 mmol·L-1ABTS和4.9 mmol·L-1K2S2O8溶液，等體積混合、搖勻，黑暗處靜置12 h，獲得ABTS母液，于734 nm處測定溶液吸光度，使用無水乙醇調(diào)節(jié)吸光度至0.700±0.002。將50 μL濃度分別為200、400、600、800、1 000、1 200、1 400 mg·L-1的樣品加入到5 mL ABTS溶液中，搖勻后避光靜置15 min，于734 nm處測定溶液吸光度。ABTS自由基清除率計算公式如下:

式中：Ai為不加樣品只加ABTS的吸光度；A為加樣品和ABTS的吸光度；A0為加樣品不加ABTS的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴里黃檀心材色素成分

根據(jù)UPLC-Q-EXACTIVE-MS檢測分析結(jié)果，得到心材色素各成分的保留時間和質(zhì)譜信息，通過與mzcloud比對二級質(zhì)譜信息，結(jié)合文獻，共鑒定出19種黃酮類成分，其中染料木素、芒柄花黃素、柚皮苷、美迪紫檀素、黃豆黃素在同屬植物降香黃檀心材成分中已有報道(Fengetal.， 2011； Leeetal.， 2013)。郭麗冰等(2007)篩選降香黃檀的有效藥理部位，發(fā)現(xiàn)活血止血的有效藥理部位為水提取液的乙酸乙酯部分，這說明在心材成分利用方面，如檀木藥茶，巴里黃檀可能對降香黃檀有潛在替代性。

正、負離子模式下總離子流見圖1，成分信息見表2。

圖1 巴里黃檀心材色素 UPLC-Q-EXACTIVE-MS的正離子(A)和負離子(B)質(zhì)譜基峰離子流

得到芒柄花黃素的濃度標準曲線為y=1 524 816.84x+ 22 189 263.00，R2= 0.998，色素中芒柄花黃素的相對含量為2.27%。

2.2 巴里黃檀心材色素穩(wěn)定性

2.2.1 pH對色素穩(wěn)定性的影響 巴里黃檀心材色素溶液pH=6。與空白樣品對比，酸性條件下(圖3)，色素在可見光區(qū)波長范圍內(nèi)的強吸收波段基本不變，吸光度隨pH降低而增大，說明酸性條件對色素穩(wěn)定性影響較小，色素中含有天竺葵素、矢車菊素等花青素，花青素會隨著溶液pH降低而變紅(吳敏等， 2008)，故酸性條件對色素具有一定增色作用。堿性條件下(圖4)，色素最大吸收峰發(fā)生藍移，在400 ～450 nm波段有強吸收，色素顏色由紅色向黃綠色轉(zhuǎn)變，pH>9時產(chǎn)生沉淀，這是因為花青素在堿性條件下變藍，且黃酮類物質(zhì)酚羥基的H+被Na+取代，對色素結(jié)構(gòu)造成一定破壞。可見，色素適宜在酸性至中性條件下儲存使用，不宜接觸堿性物質(zhì)。

2.2.2 金屬離子對色素穩(wěn)定性的影響 如圖5所示，KCl、BaCl2、NaCl、MgCl2、CaCl2對色素基本無影響，AlCl3對色素有增色作用并生成少量黃色絡(luò)合物，F(xiàn)eCl3、CuSO4、K2Cr2O7使色素溶液產(chǎn)生沉淀并變色，破壞較大。這是因為色素的主要成分為黃酮類物質(zhì)，K+、Ba2+、Na+、Mg2+、Ca2+的氧化性較弱，不會與色素發(fā)生反應(yīng)； Al3+的氧化性中等，低濃度Al3+對色素影響較?。?Fe2+、Cu2+、Cr6+的氧化性較強，能與黃酮類物質(zhì)的酚羥基反應(yīng)生成有色配合物并沉淀，與植中強等(1999)研究天然色素對金屬離子穩(wěn)定性的影響結(jié)論一致。天然染料用于織物染色時常以金屬離子作為媒染劑，起增色、固染、提高上染率的作用(韓曉俊等， 2007)，因此巴里黃檀色素用于織物染色時，K+、Ba2+、Na+、Mg2+、Ca2+可作為媒染劑使用。

表2 巴里黃檀心材色素中黃酮類成分離子結(jié)構(gòu)信息

圖3 酸性條件對巴里黃檀心材色素的影響

圖4 堿性條件對巴里黃檀心材色素的影響

2.2.3 溫度對色素穩(wěn)定性的影響 如圖6所示，60和70 ℃時色素吸光度變化幅度相對較小，色素較為穩(wěn)定； 80 ℃時色素在2 h內(nèi)較穩(wěn)定，隨著時間增長色素吸光度逐漸增大，顏色加深，色素穩(wěn)定性下降。與眾多天然色素相同(全桂靜， 2017； Inggridetal.， 2016)，巴里黃檀心材色素在低溫下穩(wěn)定而高溫下穩(wěn)定性降低，這是因為高溫促使黃酮類物質(zhì)的酚羥基氧化，生成有色醌類物質(zhì)，顏色加深(Bekhtaetal.， 2003)。因此，巴里黃檀心材色素不宜長時間處于高溫狀態(tài)下，長時間高溫加熱會使其成分發(fā)生改變，穩(wěn)定性下降。

圖6 溫度對巴里黃檀心材色素穩(wěn)定性的影響

2.2.4 紫外光照對色素穩(wěn)定性的影響 將色素溶液置于紫外光老化儀(QUV加速老化試驗機，Q-LAB公司)內(nèi)，以464.44 lux紫外光(相當于雙倍的夏季正午光照)照射，結(jié)果(圖7)顯示，隨著紫外光照時間增加，色素吸光度上升，紫外光照對色素有緩慢增色作用，這是因為黃酮類物質(zhì)的酚羥基吸收紫外光生成酮基自由基，再與氧氣結(jié)合后生成有色醌類物質(zhì)，顏色加深。心材色素氧化后顏色變深，與木材氧化顏色變深現(xiàn)象一致，木材中酚類抽提物的氧化變色也被認為是木材變色的主要來源之一(Changetal.， 2014)。

圖7 紫外光照對巴里黃檀心材色素穩(wěn)定性的影響

2.3 巴里黃檀心材色素抗氧化性

2.3.1 色素對DPPH自由基的清除能力 如圖8所示，巴里黃檀心材色素對DPPH自由基具有一定清除能力，在60 mg·L-1濃度范圍內(nèi)呈一定線性關(guān)系，160 mg·L-1濃度時對DPPH自由基的清除率可達87.25%。這是因為色素中黃酮類物質(zhì)A、B環(huán)上有多個酚羥基，C-2與C-3之間有雙鍵，還有自由的C-3-羥基和酮基，酚羥基可與自由基反應(yīng)生成較穩(wěn)定的半醌式結(jié)構(gòu)，能夠終止自由基鏈反應(yīng)(魯曉翔， 2012)，表現(xiàn)出一定抗氧化性。此外，心材色素中多種物質(zhì)如芒柄花黃素、染料木素等也均有抗氧化性(張永忠等， 2008)。巴里黃檀心材色素為巴里黃檀乙醇溶液抽提物的乙酸乙酯部位，與其同屬植物降香黃檀的抗氧化活性部位一致(姜愛莉等， 2004)。

圖8 巴里黃檀心材色素與Vc對DPPH自由基清除率的影響

2.3.2 色素對ABTS自由基的清除能力 如圖9所示，巴里黃檀心材色素對ABTS自由基也具有一定清除能力，在600 mg·L-1濃度內(nèi)呈一定線性關(guān)系，1 400 mg·L-1濃度時對ABTS自由基的清除率可達63.73%。

圖9 巴里黃檀心材色素與Vc對ABTS自由基清除率的影響

3 結(jié)論

本研究從巴里黃檀木制品加工廢料(刨花)中提取色素，使用超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-EXACTIVE-MS)法分離鑒定色素成分，對色素主要成分進行定量，探究pH、金屬離子、溫度和紫外光照對色素穩(wěn)定性的影響，分析色素對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力。從巴里黃檀心材色素中共鑒定出19種黃酮類成分，包括葒草素、葛根素、牡荊素、異鼠李素、天竺葵素、矢車菊素、高車前素、白楊素、黃豆黃素、薊黃素、櫻花素、柚皮苷、染料木素、錦葵素、香葉木素、美迪紫檀素、芒柄花黃素、高麗槐素和6-羥基黃酮，其中芒柄花黃素相對含量為2.27%。心材色素在酸性至中性環(huán)境下較為穩(wěn)定且有一定增色作用，堿性條件對色素破壞性較大，PH>9時產(chǎn)生沉淀。金屬離子K+、Na+、Ba2+、Ca2+、Mg2+對色素影響不顯著，Al3+對色素有增色作用但產(chǎn)生少量絡(luò)合物，F(xiàn)e2+、Cu2+、Cr6+對色素結(jié)構(gòu)造成破壞并使其產(chǎn)生沉淀。溫度70 ℃以下對色素穩(wěn)定性影響不顯著，超過70 ℃，加熱2 h以上色素穩(wěn)定性降低，顏色加深。6 h內(nèi)紫外光照對色素穩(wěn)定性影響不顯著，長時間光照可能使色素顏色緩慢加深。心材色素對DPPH、ABTS自由基均具有一定清除能力，可作為抗氧化劑使用。巴里黃檀心材色素提取方法簡單，具有保健功能，但也有天然色素不穩(wěn)定的特點，在使用時應(yīng)控制條件，并適當添加穩(wěn)定劑，以便更好利用。從巴里黃檀心材加工剩余物中提取色素，可為充分利用巴里黃檀資源提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，并為同類紅木資源的高效利用提供參考。