岳薇薇，葉 婷，王衛(wèi)群

(新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830001)

糖尿病腎病的患病率隨著全球糖尿病人群規(guī)模的擴(kuò)大而增高。據(jù)報(bào)道，1/3的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為糖尿病腎病[1]。糖尿病腎病的現(xiàn)有治療方法主要為控制血糖、血脂、血壓以及改變生活方式，但近50%的糖尿病腎病患者不可避免地會(huì)發(fā)展為終末期腎病，這不僅給患者帶來(lái)身體上的痛苦，而且導(dǎo)致沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2-3]。因此，迫切需要探索糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制和新的治療方法。TGF-β1是導(dǎo)致纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可通過(guò)增加細(xì)胞外基質(zhì)的形成促進(jìn)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化[4]，Smad2是TGF-β信號(hào)通路的下游效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子[5]。研究表明，TGF-β/Smad信號(hào)通路參與了糖尿病腎病的發(fā)病，可能是治療糖尿病腎病的有效靶點(diǎn)[6-7]。黃葵素為黃蜀葵花的提取物，具有清熱利濕、活血通絡(luò)的功效，其可通過(guò)減少腎組織內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及抑制促炎的M1型巨噬細(xì)胞極化緩解db/db小鼠腎臟炎癥反應(yīng),改善腎功能及腎纖維化[8]。本研究探討了黃葵素對(duì)糖尿病腎病大鼠氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和TGF-β1/Smad2信號(hào)通路的影響，旨在進(jìn)一步明確其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動(dòng)物 60只成年雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，體重200～220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001]。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中，正常飲食飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)計(jì)嚴(yán)格經(jīng)過(guò)我院倫理委員會(huì)審查。大鼠適應(yīng)環(huán)境2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2試劑 黃葵素購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院。鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。血清肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)測(cè)定試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司。尿蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司。HE染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、Masson染色試劑盒和免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。RIPA裂解液和BCA試劑盒購(gòu)自美國(guó)promega公司。兔抗TGF-β1抗體、兔抗p-Smad2抗體、兔抗Smad1抗體、β-actin抗體和山羊抗兔IgG抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、糖尿病腎病組、黃葵素低劑量組和黃葵素高劑量組，每組15只。對(duì)照組飼喂普通飼料，其余組參考文獻(xiàn)[9]方法，經(jīng)腹腔注射STZ 30 mg/kg，72 h后從尾靜脈收集血液并測(cè)定血糖，如果血糖≥16.7 mmol/L則認(rèn)為糖尿病模型成功。大鼠繼續(xù)喂食高糖高脂飲食，定期測(cè)量血糖，4周后，如果24 h尿蛋白>20 mg且尿液葡萄糖呈陽(yáng)性，則認(rèn)為糖尿病腎病模型成功。造模成功后第2天，黃葵素低劑量組和黃葵素高劑量組分別給予黃葵素75 mg/kg和150 mg/kg灌胃(給藥劑量換算參考文獻(xiàn)[10])，對(duì)照組和糖尿病腎病組給予生理鹽水灌胃，均4mL/kg，1次/d，連續(xù)8周。

1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.4.1空腹血糖(FPG)、24 h尿蛋白測(cè)定 末次灌胃結(jié)束后，各組大鼠禁食(自由飲水)一晚，第2天早晨取大鼠尾靜脈血，使用血糖儀測(cè)定FPG；使用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，采用雙縮脲法測(cè)定24 h尿蛋白量，24 h尿蛋白量=尿蛋白濃度×24 h尿量。

1.4.2血清SCr、BUN及炎癥因子水平測(cè)定 末次灌胃結(jié)束，各組大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉后，于腹主動(dòng)脈取血，置于離心管中，3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清SCr和BUN水平，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平。

1.4.3腎組織HE染色病理觀察 取大鼠腎組織，在10%中性甲醛溶液中固定至少24 h，常規(guī)脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，并制成4 μm的石蠟切片。切片放入蘇木素染液中5 min，自來(lái)水清洗后，置于1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，并用流水沖洗。切片放入伊紅染液中染色3 min，流水稍洗。之后切片置于梯度乙醇中脫水，各5 min，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明，分別5 min。將切片取出，用濾紙輕輕拭干切片上殘余的二甲苯，在組織上滴加中性樹(shù)膠封片，使用萊卡顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.4.4腎組織Masson染色觀察 取大鼠腎組織，經(jīng)OCT包埋，制成6 μm的冰凍切片；切片置于蘇木素中染色5 min，純凈水清洗；再滴加Masson藍(lán)化液返藍(lán)3～5 min，純凈水清洗；滴加一滴磷鉬酸染液染色12 min，用濾紙吸去多余染液；滴加一滴苯胺藍(lán)染色8 min后，純凈水清洗切片2 min；滴加一滴1%的醋酸孵育4 min。沖洗，用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察并拍照。藍(lán)色組織表示腎組織纖維化，紅色組織表示腎組織正常。

1.4.5腎組織免疫組織化學(xué)染色觀察 取大鼠腎組織石蠟切片，脫水，緩沖液清洗，3%過(guò)氧化氫溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加非免疫動(dòng)物血清20 min，滴加一抗，PBS沖洗，滴加二抗，沖洗后加ABC復(fù)合物，DAB顯色，中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察，用MIAS圖像分析系統(tǒng)分析，按照免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在每一高倍視野中所占比例依次統(tǒng)計(jì)。目標(biāo)蛋白呈棕黃色則為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4.6腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)水平測(cè)定 將大鼠腎組織放入到9倍體積的PBS中，用勻漿器分散到勻漿中，在4 ℃下以3 000 r/min 離心15 min，收集上清液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度(OD值)，根據(jù)OD值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出腎組織中MDA、SOD和GSH表達(dá)水平。

1.4.7腎組織中TGF-β1和p-Smad2蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)取大鼠腎組織100 mg，用RIPA裂解提取總蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h后，將PVDF膜與以下抗體在4 ℃孵育過(guò)夜：兔抗TGF-β1抗體(1∶1 000)、兔抗p-Smad2抗體(1∶1 000)、兔抗Smad2抗體(1∶1 000) 和兔抗β-actin抗體(1∶2 000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5 000)孵育1 h，用TBST洗滌3次，持續(xù)5 min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠FPG、SCr、BUN水平和24 h尿蛋白量比較 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中糖尿病腎病組1只大鼠死亡。與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠FPG、SCr、BUN水平及24 h尿蛋白量均明顯升高(P均<0.05)；與糖尿病腎病組比較，黃葵素低、高劑量組大鼠FPG、SCr、BUN水平及24 h尿蛋白量均明顯降低(P均<0.05)，且黃葵素高劑量組均明顯低于黃葵素低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠FPG、SCr、BUN水平和24 h尿蛋白量比較

2.2各組大鼠血清中炎性因子水平比較 與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平明顯升高(P均<0.05)；與糖尿病腎病組比較，黃葵素低、高劑量組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均明顯降低(P均<0.05)，且黃葵素高劑量組均明顯低于黃葵素低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6水平比較

2.3各組大鼠腎組織病理表現(xiàn) HE染色顯示，對(duì)照組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)和系膜未見(jiàn)異常變化，腎小管結(jié)構(gòu)完整；糖尿病腎病組大鼠腎組織壞死明顯，腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞大量變性，并可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞；黃葵素低、高劑量組大鼠腎小球基底膜增厚程度明顯改善，腎小球系膜基質(zhì)增生程度明顯減輕。見(jiàn)圖1。

2.4各組大鼠腎組織纖維化情況 Masson染色顯示，對(duì)照組大鼠腎小球基底膜和腎小管間質(zhì)中可見(jiàn)微量膠原；糖尿病腎病組大鼠腎小球和腎小管中觀察到大量藍(lán)色的膠原纖維；黃葵素低、高劑量組大鼠的腎小球和腎小管間質(zhì)中的膠原纖維均少于糖尿病腎病組。見(jiàn)圖2。

2.5各組大鼠腎組織中TGF-β1表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)染色顯示，對(duì)照組、糖尿病腎病組、黃葵素低劑量組、黃葵素高劑量組大鼠腎組織中TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)率分別為4.37%、43.18%、37.51%、28.94%，糖尿病腎病組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，黃葵素低、高劑量組明顯低于糖尿病腎病組(P均<0.05)，且黃葵素高劑量組明顯低于黃葵素低劑量組(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.6各組大鼠腎組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎組織中MDA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，SOD和GSH表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)；與糖尿病腎病組比較，黃葵素低、高劑量組大鼠腎組織中MDA表達(dá)水平均明顯降低(P均<0.05)，SOD和GSH表達(dá)水平均明顯升高(P均<0.05)，且黃葵素高劑量組各指標(biāo)較黃葵素低劑量組變化更明顯(P均<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠腎組織中MDA、SOD和GSH表達(dá)水平比較

2.7各組大鼠腎組織中TGF-β1和Smad2蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，糖尿病腎病組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平和Smad2蛋白的磷酸化水平均明顯增高(P均<0.05)；與糖尿病腎病組比較，黃葵素低、高劑量組大鼠腎組織中TGF-β1蛋白表達(dá)水平和Smad2蛋白的磷酸化水平均明顯降低(P均<0.05)，且黃葵素高劑量組均明顯低于黃葵素低劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討 論

糖尿病腎病的主要特征為蛋白尿、腎小球?yàn)V過(guò)減少、腎肥大和腎小管間質(zhì)纖維化[11-12]，其發(fā)生機(jī)制仍不明確，目前干預(yù)措施不能有效阻止疾病進(jìn)展，因此研究糖尿病腎病的分子機(jī)制并尋找有效的治療方法至關(guān)重要。

目前研究證實(shí)炎癥和氧化應(yīng)激與該病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6在糖尿病腎病發(fā)病中起重要作用[13]。氧化應(yīng)激標(biāo)記物可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，氧化應(yīng)激標(biāo)志物的測(cè)定在揭示糖尿病的發(fā)生和發(fā)展與氧化應(yīng)激的相關(guān)性中起著重要作用[14-15]。TGF-β1是致器官纖維化作用最強(qiáng)的促纖維化始動(dòng)因子，是糖尿病腎病發(fā)病發(fā)展過(guò)程中起關(guān)鍵作用的重要信號(hào)通路之一[16]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β/Smads信號(hào)通路在糖尿病腎病中被過(guò)度激活，TGF-β1激活受體調(diào)節(jié)的Smad2，后者與Smad4相互作用并易位至細(xì)胞核以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，在腎小球膜細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)沉積中起著重要作用[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平明顯升高，腎組織壞死明顯，腎小球萎縮，腎小管上皮細(xì)胞大量變性，并可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞，且腎小球和腎小管中觀察到大量藍(lán)色的膠原纖維，腎組織中大量TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)，腎組織中MDA水平、TGF-β1蛋白表達(dá)水平和Smad2蛋白的磷酸化水平顯著升高，而SOD和GSH水平明顯降低。說(shuō)明糖尿病腎病大鼠存在明顯炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，腎組織損傷，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。

黃葵素是由黃蜀葵花醇提獲得，主要成分為黃蜀葵花總黃酮。既往研究發(fā)現(xiàn)，黃葵素可減輕糖尿病腎病尿蛋白，具有明顯腎保護(hù)作用，機(jī)制可能與抑制NF-κB p65炎性反應(yīng)信號(hào)通路及促炎因子釋放有關(guān)[10]。錢(qián)曉翠[20]研究報(bào)道，黃葵素干預(yù)可降低糖尿病腎病大鼠血糖、尿蛋白含量，其可能通過(guò)抑制肝素結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子樣生長(zhǎng)因子(HB-EGF)的表達(dá)而發(fā)揮腎保護(hù)作用 。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，黃葵素干預(yù)后，糖尿病腎病大鼠FPG、SCr、BUN、24 h尿蛋白量、IL-1β、TNF-α、IL-6水平及腎組織中MDA水平、TGF-β1蛋白表達(dá)水平、Smad2蛋白的磷酸化水平均明顯降低，而SOD和GSH水平均明顯升高，提示黃葵素能改善糖尿病腎病大鼠腎功能，減輕炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，抑制TGF-β1/Smad2通路的激活。

綜上所述，TGF-β1/Smad2信號(hào)通路與糖尿病腎病之間存在相關(guān)性，黃葵素可減輕炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激，抑制TGF-β1/Smad2通路的激活，從而改善糖尿病腎病的病情，保護(hù)腎功能。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。