何由之，蔡兵

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院普外科 無(wú)錫 214023）

胰腺癌是一個(gè)具有侵略性的腫瘤，胰腺癌是死亡率最高的癌癥之一，與較差的生存率相關(guān)[1，2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)胰腺癌患者的5年生存率不到9%[3]，目前手術(shù)治療是臨床上有效的治療方式，然而由于胰腺癌晚期和具有轉(zhuǎn)移性，導(dǎo)致手術(shù)的切除腫瘤的治療方法僅適用于少部分的患者[4]，因此尋找胰腺癌新的治療靶點(diǎn)非常重要。鋅脂蛋白488（zinc finger protein 488， ZNF488）是辛脂蛋白家族中的成員，可參與調(diào)控癌細(xì)胞的進(jìn)程。有研究表明，ZNF488基因在鼻咽喉癌細(xì)胞中高表達(dá)，且過(guò)表達(dá)的ZNF488可促進(jìn)鼻咽喉癌細(xì)胞的增殖和遷移[5]，同時(shí)也有研究證實(shí)，敲低ZNF488的表達(dá)，可顯著抑制輔導(dǎo)誘導(dǎo)的鼻咽喉癌細(xì)胞的遷移侵襲能力[6-7]。但是關(guān)于ZNF488在腫瘤調(diào)控中的作用機(jī)制還研究較少。本研究在前期研究中發(fā)現(xiàn)ZNF488在胰腺癌中高表達(dá)，然而關(guān)于ZNF488在胰腺癌中的作用和調(diào)控機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。已有研究證實(shí)PI3K/AKT通路在胰腺癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，例如，MMP28可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT通路影響胰腺癌的進(jìn)程[8]；敲低TBL1XR1的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制與PI3K/AKT通路有關(guān)[9]。但ZNF488在胰腺癌中的調(diào)控機(jī)制是否也跟調(diào)控PI3K/AKT通路相關(guān)還不清楚。本研究旨在探討ZNF488在胰腺癌中的調(diào)控機(jī)制，為胰腺癌的靶向治療提供可參考的理論依據(jù)。

材料與方法

1 試劑

胰腺癌Capan-1細(xì)胞購(gòu)自于ATCC公司（編號(hào)：bio-69384）；抗ZNF488抗體、抗Cleaved-Caspase-3抗體、抗Bax抗體、抗vimentin抗體、抗PI3K抗體、抗p-PI3K抗體、抗AKT抗體、抗p-AKT抗體、抗GAPDH（內(nèi)參蛋白）抗體購(gòu)自于Abcam公司；抗E-cadherin抗體購(gòu)自艾美捷科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%的青霉素/ 鏈霉素液、Lipofectamine 2000、購(gòu)自Invitrogen公司；CCK-8試劑盒、胰蛋白酶、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；對(duì)照siRNA（si-NC）和si-ZNF488序列購(gòu)自上海吉瑪公司；激動(dòng)劑740Y-P（貨號(hào)：HY-P0175）購(gòu)自MCE（中國(guó)）公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

胰腺癌細(xì)胞Capan-1培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清、1%的青霉素/鏈霉素液的RPMI-1640培養(yǎng)基中，并在條件為5% CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine 2000試劑操作說(shuō)明書(shū)分別將si-NC、si- ZNF488轉(zhuǎn)染Capan-1細(xì)胞，然后用25 nmol/L PI3K/AKT通路激活劑740Y-P處理被轉(zhuǎn)染si-ZNF488的Capan-1細(xì)胞，胰腺癌Capan-1細(xì)胞被分為si-NC組、si-ZNF488組和si-ZNF488+740Y-P組。

3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)期的各組Capan-1細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸浮液，按密度為2000/孔接種于96孔板中后，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)2～4 h（細(xì)胞貼壁）后，室溫避光加入10 μL的CCK8試劑，在培養(yǎng)箱中避光孵育1～3 h，然后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)吸光值。之后每天的同一時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8試劑，避光孵育后檢測(cè)OD值，共檢測(cè)4 d。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-1細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后，棄上清，加入200 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞，濃度調(diào)為1×106/mL，離心后棄上清，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC與PI后，室溫避光孵育20 min，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-1細(xì)胞，進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)：PBS洗滌后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，在24孔板底部（下室）加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，上室加入1×105個(gè)細(xì)胞，5%CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用多聚甲醛（4%）固定后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察；侵襲實(shí)驗(yàn)在上室加入細(xì)胞之前，先在上室均勻的鋪上100 μL的基質(zhì)膠稀釋液，隨后培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～4 h后再接種細(xì)胞，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

6 Westren blot分析

收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解20 min后提取總蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，之后用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳等量分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%的脫脂奶粉封閉2 h（室溫），加入ZNF488（1:1000）、Cleaved-Caspase-3（1:500）、Bax（1:500）、E-cadherin（1:500）、vimentin（1:1000）、PI3K（1:1000）、p-PI3K（1:1000）、AKT（1:1000）、p-AKT（1:1000）、GAPDH（1:1000）一抗后4 ℃過(guò)夜。次日用PBS洗膜后HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:2000）孵育后ECL顯影、拍片，應(yīng)用Image J軟件對(duì)各蛋白條帶光密度進(jìn)行定量分析，以各目的蛋白光密度與內(nèi)參蛋白GAPDH光密度比值代表各目的蛋白相對(duì)水平。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS22.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，GraphPad 8.0制作圖表，兩組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間比較用單因素方差分析，每組重復(fù)3次，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ZNF488在胰腺癌中高表達(dá)并與總生存負(fù)相關(guān)

TCGA在線數(shù)據(jù)（http://ualcan.path.uab.edu/analysis-mir.html）分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，腫瘤組織中ZNF488的相對(duì)表達(dá)量顯著增高（圖1A），與ZNF488低表達(dá)組患者相比，ZNF488高表達(dá)組患者的生存時(shí)間較短（圖1B）。

圖1 胰腺癌中ZNF488表達(dá)及與總生存關(guān)系的TCGA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析。*P＜0.05Fig. 1 TCGA online database analysis of relationship between ZNF488 expression and overall patient survival in pancreatic cancer. *P＜0.05

2 干擾ZNF488抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡

Western blot檢測(cè)證明本實(shí)驗(yàn)所用si-ZNF488序列能有效干擾Capan-1細(xì)胞的ZNF488蛋白表達(dá)（圖2A）。CCK-8檢測(cè)顯示：在轉(zhuǎn)染后72 h時(shí)，si-ZNF488組的細(xì)胞增殖較si-NC組明顯下降；si-ZNF488+740Y-P組的細(xì)胞增殖較si-ZNF488組有所增加，但仍低于si-NC組（圖2B）。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)：si-ZNF488組的細(xì)胞凋亡率明顯高于si-NC組；si-ZNF488+740Y-P組的細(xì)胞凋亡率明顯低于si-ZNF488組，但仍高于si-NC組（圖2C）。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，si-ZNF488組的促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax水平較si-NC組顯著增加；si-ZNF488+740Y-P組Cleaved-Caspase-3和Bax顯著低于si-ZNF-488組，但仍高于si-NC組（圖2D）。這些結(jié)果說(shuō)明干擾ZNF488的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌Capan-1細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而PI3K/AKT通路激活劑可阻斷或減輕干擾ZNF488對(duì)Capan-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

圖2 干擾ZNF488對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。A，Western blot 檢測(cè)ZNF488干擾效率；A1，ZNF488水平代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果；A2，ZNF488水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。C，細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；C1，代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果；C2，細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；D，Western blot 檢細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平；D1，Cleaved-caspase-3 （C-Caspase-3）和Bax水平代表性Western blot 檢測(cè)結(jié)果； D2，C-Caspase-3和Bax水平統(tǒng)計(jì)分析圖。 *P＜0.05Fig. 2 Effect of interfering ZNF488 on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells. A， Western blot detection for the knock-down efficiency of ZNF488; A1， representative Western blot result for ZNF488 expression level; A2， statistical analysis of ZNF488 level with Western blot detection. B， CCK-8 detection for cell proliferation. C， flow cytometry detection for cell apoptosis; C1， representative flow cytometry detection; C2， statistical analysis of flow cytometry results. D， Western blot detection for apoptosis-related proteins， D1， representative Western blot results for Cleaved-caspase-3 (C-Caspase-3) and Bax level; D2， statistical analysis of C-Caspase-3 and Bax level . *P＜0.05

3 敲低ZNF488抑制Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示：si-ZNF488組Capan-1細(xì)胞遷移和侵襲能力較si-NC組顯著下降；si-ZNF488+740Y-P組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)較si-ZNF488組明顯增加，略低于si-NC組（圖3A、B）。Western blot檢測(cè)表明：si-ZNF488組E-cadherin和vimentin水平較si-NC組顯著降低和增高； si-ZNF488+740YP組的E-cadherin和vimentin水平較si-ZNF488組顯著增高和降低，但略低于和略高于si-NC組。這些變化說(shuō)明干擾ZNF488可顯著抑制胰腺癌Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲，而PI3K/AKT通路激活劑逆轉(zhuǎn)了干擾ZNF488對(duì)胰腺癌Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲的抑制作用。

圖3 干擾ZNF488對(duì)Capan-1細(xì)胞遷移侵襲的影響。A1，Capan-1細(xì)胞遷移力的代表性Transwell檢測(cè)結(jié)果；A2，Capan-1細(xì)胞遷移力的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B1，Capan-1細(xì)胞侵襲力的代表性Transwell檢測(cè)結(jié)果；B2，Capan-1細(xì)胞侵襲力的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C1，EMT相關(guān)蛋白水平的代表性Western blot 檢測(cè)；C2，EMT相關(guān)蛋白水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖。*P＜0.05Fig. 3 Effect of interfering ZNF488 on migration and invasion of Capan-1 cells. A1， representative Transwell detection for Capan-1 cell migration; A2， statistical analysis of Capan-1 cell migration detected by Transwell. B1， representative Transwell detection for Capan-1 cell invasion; A2， statistical analysis of Capan-1 cell invasion detected by Transwell. C1， representative Western blot detection for EMT-related protein levels; C2， statistical analysis of EMT-related proteins detected by Western blot. *P＜0.05

4 敲低ZNF488下調(diào)Capan-1細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白水平

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：si-ZNF488組的PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白p-PI3K和p-AKT水平均顯著下調(diào)； si-ZNF488+740Y-P組的p-PI3K和p-AKT水平均較si-ZNF488水平顯著上調(diào)，但仍低于si-NC組。因此，ZNF488可通過(guò)PI3K/AKT通路發(fā)揮對(duì)Capan-1細(xì)胞的調(diào)控。

討 論

胰腺癌是生存率較低、預(yù)后較差以及侵襲性較高的一種惡性腫瘤[10]?；熀屯饪剖中g(shù)治療是目前臨床上治療胰腺癌的主要手段[11]，然而傳統(tǒng)的治療手段對(duì)于胰腺癌患者的生存率并不理想[3]。因此尋找胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制非常重要。鋅脂蛋白488（ZNF488）被證實(shí)是一種致癌基因，有研究表明ZNF488可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin/GSK3β通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和侵襲，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]，同時(shí)也有研究表明，與低表達(dá)ZNF488的鼻咽癌患者比較，高表達(dá)ZNF488的鼻咽癌患者總生存期、局部區(qū)域無(wú)復(fù)發(fā)生存期以及無(wú)距離轉(zhuǎn)移生存期較差[13]。然而近年來(lái)關(guān)于ZNF488的促腫瘤作用在鼻咽癌中的研究較多，而在胰腺癌中的作用機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)ZNF488在胰腺癌患者組織中高表達(dá)，且ZNF488高表達(dá)的胰腺癌患者生存較差，同時(shí)本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，敲低ZNF488可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，再次證明了ZNF488的促癌作用，并首次證實(shí)了ZNF488在胰腺癌中的促癌作用。

圖4 干擾ZNF488對(duì)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A，PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白水平的代表性Western blot 檢測(cè)；B，PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白水平定量統(tǒng)計(jì)分析； *P＜0.05Fig. 4 Effect of interfering ZNF488 on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins. A， representative Western blot detection of PI3K/AKT pathway-related protein levels; B， statistical analysis of PI3K/AKT pathway-related proteins with Western blot detection; *P＜0.05

研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路可介導(dǎo)胃癌、食管癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14-16]，研究已經(jīng)證實(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路的失調(diào)在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中同樣具有重要的意義，例如，最新的研究發(fā)現(xiàn)miR-30d可通過(guò)調(diào)控SOX4的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響胰腺癌的進(jìn)程[17]；Li等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞來(lái)源的miR-365可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展；這提示ZNF488在胰腺癌中的促癌作用可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低ZNF488后，PI3K/AKT信號(hào)通路的相關(guān)蛋白p-PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，表明敲低ZNF488可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲。740Y-P為PI3K/AKT信號(hào)通路的激活劑，本研究發(fā)現(xiàn)740Y-P可逆轉(zhuǎn)敲低ZNF488對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，再次證明ZNF488可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上，本研究首次證實(shí)ZNF488在胰腺癌細(xì)胞中的調(diào)控作用，并且明確了ZNF488在胰腺癌中通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平進(jìn)而發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制，提示ZNF488有望成為胰腺癌靶向治療的靶點(diǎn)，為胰腺癌的靶向治療提供了新的參考依據(jù)。