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ZNF488通過(guò)PI3K/AKT通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲并抑制其凋亡

2021-04-09 07:37:54何由之蔡兵
關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱胰腺癌調(diào)控

何由之,蔡兵

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市人民醫(yī)院普外科 無(wú)錫 214023)

胰腺癌是一個(gè)具有侵略性的腫瘤,胰腺癌是死亡率最高的癌癥之一,與較差的生存率相關(guān)[1,2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)胰腺癌患者的5年生存率不到9%[3],目前手術(shù)治療是臨床上有效的治療方式,然而由于胰腺癌晚期和具有轉(zhuǎn)移性,導(dǎo)致手術(shù)的切除腫瘤的治療方法僅適用于少部分的患者[4],因此尋找胰腺癌新的治療靶點(diǎn)非常重要。鋅脂蛋白488(zinc finger protein 488, ZNF488)是辛脂蛋白家族中的成員,可參與調(diào)控癌細(xì)胞的進(jìn)程。有研究表明,ZNF488基因在鼻咽喉癌細(xì)胞中高表達(dá),且過(guò)表達(dá)的ZNF488可促進(jìn)鼻咽喉癌細(xì)胞的增殖和遷移[5],同時(shí)也有研究證實(shí),敲低ZNF488的表達(dá),可顯著抑制輔導(dǎo)誘導(dǎo)的鼻咽喉癌細(xì)胞的遷移侵襲能力[6-7]。但是關(guān)于ZNF488在腫瘤調(diào)控中的作用機(jī)制還研究較少。本研究在前期研究中發(fā)現(xiàn)ZNF488在胰腺癌中高表達(dá),然而關(guān)于ZNF488在胰腺癌中的作用和調(diào)控機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。已有研究證實(shí)PI3K/AKT通路在胰腺癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,例如,MMP28可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT通路影響胰腺癌的進(jìn)程[8];敲低TBL1XR1的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲,其機(jī)制與PI3K/AKT通路有關(guān)[9]。但ZNF488在胰腺癌中的調(diào)控機(jī)制是否也跟調(diào)控PI3K/AKT通路相關(guān)還不清楚。本研究旨在探討ZNF488在胰腺癌中的調(diào)控機(jī)制,為胰腺癌的靶向治療提供可參考的理論依據(jù)。

材料與方法

1 試劑

胰腺癌Capan-1細(xì)胞購(gòu)自于ATCC公司(編號(hào):bio-69384);抗ZNF488抗體、抗Cleaved-Caspase-3抗體、抗Bax抗體、抗vimentin抗體、抗PI3K抗體、抗p-PI3K抗體、抗AKT抗體、抗p-AKT抗體、抗GAPDH(內(nèi)參蛋白)抗體購(gòu)自于Abcam公司;抗E-cadherin抗體購(gòu)自艾美捷科技有限公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%的青霉素/ 鏈霉素液、Lipofectamine 2000、購(gòu)自Invitrogen公司;CCK-8試劑盒、胰蛋白酶、RIPA裂解液、BCA試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;對(duì)照siRNA(si-NC)和si-ZNF488序列購(gòu)自上海吉瑪公司;激動(dòng)劑740Y-P(貨號(hào):HY-P0175)購(gòu)自MCE(中國(guó))公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

胰腺癌細(xì)胞Capan-1培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清、1%的青霉素/鏈霉素液的RPMI-1640培養(yǎng)基中,并在條件為5% CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine 2000試劑操作說(shuō)明書(shū)分別將si-NC、si- ZNF488轉(zhuǎn)染Capan-1細(xì)胞,然后用25 nmol/L PI3K/AKT通路激活劑740Y-P處理被轉(zhuǎn)染si-ZNF488的Capan-1細(xì)胞,胰腺癌Capan-1細(xì)胞被分為si-NC組、si-ZNF488組和si-ZNF488+740Y-P組。

3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)期的各組Capan-1細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸浮液,按密度為2000/孔接種于96孔板中后,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)2~4 h(細(xì)胞貼壁)后,室溫避光加入10 μL的CCK8試劑,在培養(yǎng)箱中避光孵育1~3 h,然后用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450 nm處檢測(cè)吸光值。之后每天的同一時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8試劑,避光孵育后檢測(cè)OD值,共檢測(cè)4 d。

4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-1細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞,胰蛋白酶消化細(xì)胞,離心后,棄上清,加入200 μL 1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,濃度調(diào)為1×106/mL,離心后棄上清,分別加入5 μL 的Annexin V-FITC與PI后,室溫避光孵育20 min,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Capan-1細(xì)胞,進(jìn)行遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn):PBS洗滌后用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,在24孔板底部(下室)加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,上室加入1×105個(gè)細(xì)胞,5%CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,用多聚甲醛(4%)固定后結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察;侵襲實(shí)驗(yàn)在上室加入細(xì)胞之前,先在上室均勻的鋪上100 μL的基質(zhì)膠稀釋液,隨后培養(yǎng)箱培養(yǎng)1~4 h后再接種細(xì)胞,其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

6 Westren blot分析

收集細(xì)胞,加入RIPA裂解液裂解20 min后提取總蛋白,用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,之后用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳等量分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜,用5%的脫脂奶粉封閉2 h(室溫),加入ZNF488(1:1000)、Cleaved-Caspase-3(1:500)、Bax(1:500)、E-cadherin(1:500)、vimentin(1:1000)、PI3K(1:1000)、p-PI3K(1:1000)、AKT(1:1000)、p-AKT(1:1000)、GAPDH(1:1000)一抗后4 ℃過(guò)夜。次日用PBS洗膜后HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1:2000)孵育后ECL顯影、拍片,應(yīng)用Image J軟件對(duì)各蛋白條帶光密度進(jìn)行定量分析,以各目的蛋白光密度與內(nèi)參蛋白GAPDH光密度比值代表各目的蛋白相對(duì)水平。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS22.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),GraphPad 8.0制作圖表,兩組之間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組之間比較用單因素方差分析,每組重復(fù)3次,P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ZNF488在胰腺癌中高表達(dá)并與總生存負(fù)相關(guān)

TCGA在線數(shù)據(jù)(http://ualcan.path.uab.edu/analysis-mir.html)分析結(jié)果顯示,與正常組織相比,腫瘤組織中ZNF488的相對(duì)表達(dá)量顯著增高(圖1A),與ZNF488低表達(dá)組患者相比,ZNF488高表達(dá)組患者的生存時(shí)間較短(圖1B)。

圖1 胰腺癌中ZNF488表達(dá)及與總生存關(guān)系的TCGA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析。*P<0.05Fig. 1 TCGA online database analysis of relationship between ZNF488 expression and overall patient survival in pancreatic cancer. *P<0.05

2 干擾ZNF488抑制胰腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡

Western blot檢測(cè)證明本實(shí)驗(yàn)所用si-ZNF488序列能有效干擾Capan-1細(xì)胞的ZNF488蛋白表達(dá)(圖2A)。CCK-8檢測(cè)顯示:在轉(zhuǎn)染后72 h時(shí),si-ZNF488組的細(xì)胞增殖較si-NC組明顯下降;si-ZNF488+740Y-P組的細(xì)胞增殖較si-ZNF488組有所增加,但仍低于si-NC組(圖2B)。流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn):si-ZNF488組的細(xì)胞凋亡率明顯高于si-NC組;si-ZNF488+740Y-P組的細(xì)胞凋亡率明顯低于si-ZNF488組,但仍高于si-NC組(圖2C)。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),si-ZNF488組的促凋亡蛋白Cleaved-Caspase-3和Bax水平較si-NC組顯著增加;si-ZNF488+740Y-P組Cleaved-Caspase-3和Bax顯著低于si-ZNF-488組,但仍高于si-NC組(圖2D)。這些結(jié)果說(shuō)明干擾ZNF488的表達(dá)可顯著抑制胰腺癌Capan-1細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,而PI3K/AKT通路激活劑可阻斷或減輕干擾ZNF488對(duì)Capan-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

圖2 干擾ZNF488對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。A,Western blot 檢測(cè)ZNF488干擾效率;A1,ZNF488水平代表性Western blot檢測(cè)結(jié)果;A2,ZNF488水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B,CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖。C,細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè);C1,代表性流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果;C2,細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;D,Western blot 檢細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平;D1,Cleaved-caspase-3 (C-Caspase-3)和Bax水平代表性Western blot 檢測(cè)結(jié)果; D2,C-Caspase-3和Bax水平統(tǒng)計(jì)分析圖。 *P<0.05Fig. 2 Effect of interfering ZNF488 on proliferation and apoptosis of pancreatic cancer cells. A, Western blot detection for the knock-down efficiency of ZNF488; A1, representative Western blot result for ZNF488 expression level; A2, statistical analysis of ZNF488 level with Western blot detection. B, CCK-8 detection for cell proliferation. C, flow cytometry detection for cell apoptosis; C1, representative flow cytometry detection; C2, statistical analysis of flow cytometry results. D, Western blot detection for apoptosis-related proteins, D1, representative Western blot results for Cleaved-caspase-3 (C-Caspase-3) and Bax level; D2, statistical analysis of C-Caspase-3 and Bax level . *P<0.05

3 敲低ZNF488抑制Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示:si-ZNF488組Capan-1細(xì)胞遷移和侵襲能力較si-NC組顯著下降;si-ZNF488+740Y-P組的遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)較si-ZNF488組明顯增加,略低于si-NC組(圖3A、B)。Western blot檢測(cè)表明:si-ZNF488組E-cadherin和vimentin水平較si-NC組顯著降低和增高; si-ZNF488+740YP組的E-cadherin和vimentin水平較si-ZNF488組顯著增高和降低,但略低于和略高于si-NC組。這些變化說(shuō)明干擾ZNF488可顯著抑制胰腺癌Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲,而PI3K/AKT通路激活劑逆轉(zhuǎn)了干擾ZNF488對(duì)胰腺癌Capan-1細(xì)胞的遷移和侵襲的抑制作用。

圖3 干擾ZNF488對(duì)Capan-1細(xì)胞遷移侵襲的影響。A1,Capan-1細(xì)胞遷移力的代表性Transwell檢測(cè)結(jié)果;A2,Capan-1細(xì)胞遷移力的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。B1,Capan-1細(xì)胞侵襲力的代表性Transwell檢測(cè)結(jié)果;B2,Capan-1細(xì)胞侵襲力的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。C1,EMT相關(guān)蛋白水平的代表性Western blot 檢測(cè);C2,EMT相關(guān)蛋白水平統(tǒng)計(jì)學(xué)分析圖。*P<0.05Fig. 3 Effect of interfering ZNF488 on migration and invasion of Capan-1 cells. A1, representative Transwell detection for Capan-1 cell migration; A2, statistical analysis of Capan-1 cell migration detected by Transwell. B1, representative Transwell detection for Capan-1 cell invasion; A2, statistical analysis of Capan-1 cell invasion detected by Transwell. C1, representative Western blot detection for EMT-related protein levels; C2, statistical analysis of EMT-related proteins detected by Western blot. *P<0.05

4 敲低ZNF488下調(diào)Capan-1細(xì)胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白水平

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn):si-ZNF488組的PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白p-PI3K和p-AKT水平均顯著下調(diào); si-ZNF488+740Y-P組的p-PI3K和p-AKT水平均較si-ZNF488水平顯著上調(diào),但仍低于si-NC組。因此,ZNF488可通過(guò)PI3K/AKT通路發(fā)揮對(duì)Capan-1細(xì)胞的調(diào)控。

討 論

胰腺癌是生存率較低、預(yù)后較差以及侵襲性較高的一種惡性腫瘤[10]?;熀屯饪剖中g(shù)治療是目前臨床上治療胰腺癌的主要手段[11],然而傳統(tǒng)的治療手段對(duì)于胰腺癌患者的生存率并不理想[3]。因此尋找胰腺癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制非常重要。鋅脂蛋白488(ZNF488)被證實(shí)是一種致癌基因,有研究表明ZNF488可通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin/GSK3β通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和侵襲,誘導(dǎo)癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[12],同時(shí)也有研究表明,與低表達(dá)ZNF488的鼻咽癌患者比較,高表達(dá)ZNF488的鼻咽癌患者總生存期、局部區(qū)域無(wú)復(fù)發(fā)生存期以及無(wú)距離轉(zhuǎn)移生存期較差[13]。然而近年來(lái)關(guān)于ZNF488的促腫瘤作用在鼻咽癌中的研究較多,而在胰腺癌中的作用機(jī)制還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)在線數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)ZNF488在胰腺癌患者組織中高表達(dá),且ZNF488高表達(dá)的胰腺癌患者生存較差,同時(shí)本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),敲低ZNF488可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,再次證明了ZNF488的促癌作用,并首次證實(shí)了ZNF488在胰腺癌中的促癌作用。

圖4 干擾ZNF488對(duì)PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。A,PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白水平的代表性Western blot 檢測(cè);B,PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白水平定量統(tǒng)計(jì)分析; *P<0.05Fig. 4 Effect of interfering ZNF488 on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins. A, representative Western blot detection of PI3K/AKT pathway-related protein levels; B, statistical analysis of PI3K/AKT pathway-related proteins with Western blot detection; *P<0.05

研究表明,PI3K/AKT信號(hào)通路可介導(dǎo)胃癌、食管癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14-16],研究已經(jīng)證實(shí),PI3K/AKT信號(hào)通路的失調(diào)在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中同樣具有重要的意義,例如,最新的研究發(fā)現(xiàn)miR-30d可通過(guò)調(diào)控SOX4的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路影響胰腺癌的進(jìn)程[17];Li等[18]在研究中發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞來(lái)源的miR-365可通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展;這提示ZNF488在胰腺癌中的促癌作用可能通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低ZNF488后,PI3K/AKT信號(hào)通路的相關(guān)蛋白p-PI3K和p-AKT的蛋白表達(dá)水平均下調(diào),表明敲低ZNF488可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移侵襲。740Y-P為PI3K/AKT信號(hào)通路的激活劑,本研究發(fā)現(xiàn)740Y-P可逆轉(zhuǎn)敲低ZNF488對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響,再次證明ZNF488可通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。

綜上,本研究首次證實(shí)ZNF488在胰腺癌細(xì)胞中的調(diào)控作用,并且明確了ZNF488在胰腺癌中通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白水平進(jìn)而發(fā)揮作用的調(diào)控機(jī)制,提示ZNF488有望成為胰腺癌靶向治療的靶點(diǎn),為胰腺癌的靶向治療提供了新的參考依據(jù)。

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