張旭，曾智，熊曉星*

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院1神經(jīng)外科，2病理科，武漢 430060）

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)發(fā)病率最高的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是WHO Ⅳ級的高級別星形細(xì)胞腫瘤，具有惡性程度高、預(yù)后差、死亡率高等特點(diǎn)；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤確診后，患者平均生存時間約為12個月[1，2]。顱內(nèi)占位切除配合術(shù)后放化療是目前臨床治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要手段，但由于腫瘤侵襲性強(qiáng)，與周邊正常腦組織邊界不清，導(dǎo)致手術(shù)治療效果相較于其他顱內(nèi)腫瘤更差。除此之外，放化療的應(yīng)用對GBM患者整體預(yù)后影響的作用也較為有限[3]。

甲基化是細(xì)胞表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要方式，甲基化通過影響基因組基因轉(zhuǎn)錄、翻譯過程的穩(wěn)定，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)，對包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要影響，并有一定的診斷、治療指導(dǎo)意義[4]。甲基轉(zhuǎn)移樣酶1（methyltransferase-like 1，METTL1）是一類RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，通過催化tRNA m7G修飾，驅(qū)動細(xì)胞腫瘤樣轉(zhuǎn)化，并在肺癌、胃癌及肝內(nèi)膽管癌等惡性腫瘤的研究中被認(rèn)為有促癌效應(yīng)[5-7]。有分析表明tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因擴(kuò)增是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的常見現(xiàn)象，而METTL1被鑒定為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中擴(kuò)增最高的tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶[8]。本文檢測METTL1蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常腦組織中的表達(dá)及定位，并結(jié)合患者臨床病理特征，探討METTL1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材料與方法

1 臨床資料與組織標(biāo)本

收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院2018年1月至2021年1月病理確診為腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的病例60例，收集患者的臨床病理資料（性別、年齡、腫物大小，病灶部位、病灶原發(fā)/復(fù)發(fā)性質(zhì)、術(shù)后復(fù)發(fā)情況、轉(zhuǎn)移情況、基因檢測）。并收集同時期因腦外傷手術(shù)取出正常腦組織送檢的病例10例作為陰性對照。所有患者均簽署知情同意書。找出70例患者對應(yīng)的HE染色切片及組織蠟塊，組織HE染色切片重新閱片選點(diǎn)并于蠟塊做相應(yīng)標(biāo)記后制成組織芯片。

2 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析

從UCSC Xnea網(wǎng)站（https://xenabrowser.net/）下載TCGA Glioblastoma（GBM）數(shù)據(jù)庫，篩選出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常腦組織中基因表達(dá)數(shù)據(jù)及相關(guān)病例臨床病理資料進(jìn)行分析。從門戶網(wǎng)站Depmap （https://depmap.org/portal/）中下載阿喀琉斯項(xiàng)目（Project Achilles，https://depmap.org/portal/achilles/）全基因組CRISPR/Cas9敲除文庫篩選數(shù)據(jù)，并分析該計(jì)劃通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除多種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系內(nèi)METTL1表達(dá)后，計(jì)算得出的提示關(guān)鍵基因可能性的Chronos依賴度評分。

3 免疫熒光染色

組織切片二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇水化后，檸檬酸鹽溶液微波抗原修復(fù)，室溫封閉后，兔抗人METTL1多克隆抗體（14994-1-AP，Proteintech，Wuhan，China，工作濃度1:400）分別與鼠抗人GFAP單克隆抗體（ab4648，Abcam USA，工作濃度1:100）或鼠抗人NeuN單克隆抗體（ab104224，Abcam USA，工作濃度1:100）混合后4 ℃過夜孵育，次日復(fù)溫后，用山羊抗兔紅色熒光二抗（ab150080，Abcam USA，工作濃度1:1000）及山羊抗鼠綠色熒光二抗（ab150117，Abcam USA，工作濃度1:1000）混合孵育，漂洗后滴加含DAPI的抗熒光淬滅封片劑，蓋玻片封片后放于暗盒，4℃保存，并用正置熒光顯微鏡閱片并采集圖像。

4 SP法免疫組織化學(xué)染色

即用型免疫組織化學(xué)UltraSensitive SP超敏試劑盒（鼠/兔，KIT- 9710）和 DAB 顯色試劑盒購自福州邁新公司。一抗為兔抗人METTL1多克隆抗體。組織芯片二甲苯脫蠟，梯度濃度乙醇水化后，檸檬酸鹽溶液微波抗原修復(fù)，后續(xù)按試劑盒說明書滴加試劑進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，其中一抗稀釋至1:400工作濃度后，4 ℃過夜孵育。

5 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)結(jié)果由兩位臨床病理醫(yī)師獨(dú)立閱片讀取。METTL1主要在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及正常腦組織細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，半定量積分法評估陽性細(xì)胞數(shù)及陽性表達(dá)強(qiáng)度。染色強(qiáng)度方面：無陽性著色為0分，著色強(qiáng)度呈淺黃色為1分，黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細(xì)胞比例方面：＜10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。表達(dá)水平采用兩項(xiàng)結(jié)果乘積（Score = 0—12，圖1）為最終結(jié)果：≤6分為陰性組，＞6分為陽性組。

圖1 METTL1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常腦組織中表達(dá)的SP 法免疫組織化學(xué)染色與評分。黑箭頭示神經(jīng)元細(xì)胞，白箭頭示星形膠質(zhì)細(xì)胞。比例尺：A，B，E—H，100 μm；C和D，20 μmFig. 1 SP immunohistochemical staining of METTL1 expression and scoring in glioblastoma and normal brain tissues. The black arrows point to neurons， and the white arrows point to astrocytes. Scale bar， A， B， E to H， 100μm; C， D， 20μm

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS22.0軟件，計(jì)數(shù)資料用率表示，并用χ2及Fisher精確檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 METTL1定位于正常人腦神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)

蛋白分析網(wǎng)站The Human Protein Atlas（www.proteinatlas.org）收錄了METTL1在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-251、人前列腺癌細(xì)胞系PC-3和人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)-431中的免疫熒光表達(dá)，均顯示METTL1主要富集在細(xì)胞核中，在胞質(zhì)內(nèi)也可見少許表達(dá)（圖2）。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光結(jié)果與蛋白分析網(wǎng)站The Human Protein Atlas中的結(jié)果符合，顯示METTL1廣泛表達(dá)在正常腦組織神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中，但METTL1在神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)量要明顯高于星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖3）。

圖2 METTL1在U-251、PC-3和A-431細(xì)胞系中的表達(dá)定位。比例尺，20μmFig. 2 Expression and localization of METTL1 in the U-251， PC-3 and A-431cell lines. Scale bar，20μm

圖3 METTL1蛋白在正常腦組織中的表達(dá)。長箭示神經(jīng)元，短箭頭示星形膠質(zhì)細(xì)胞。比例尺，100μm。Fig. 3 Expression of METTL1 protein in normal brain tissues. The long arrows indicate the neurons， and the short arrow heads indicate the astrocytes. Scale bar， 100μm

2 METTL1 mRNA在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)水平較正常人腦組織高

TCGA數(shù)據(jù)庫TCGA Glioblastoma（GBM）收錄了631例人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常人腦組織標(biāo)本mRNA表達(dá)水平信息，其中167例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及5例正常腦組織有METTL1的mRNA表達(dá)水平數(shù)據(jù)。對兩種組織中METTL1 mRNA表達(dá)水平的比較顯示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中METTL1 mRNA 水平顯著高于正常腦組織（P＜0.001）（圖4）。

圖4 METTL1 mRNA水平在正常腦組織和和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的差異Fig. 4 Difference of METTL1 mRNA levels between normal brain tissue and glioblastoma tissue

3 METTL1蛋白在人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平較正常人腦組織高

組織芯片上含有60例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及10例腦外傷術(shù)中取出的正常腦組織，經(jīng)過免疫組織化學(xué)染色及形態(tài)學(xué)閱片后發(fā)現(xiàn)，有 54例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織具有完整的腫瘤成分，其余位點(diǎn)存在掉點(diǎn)或結(jié)果無法判讀，而10例正常腦組織保持完整；METTL1陽性信號主要定位于細(xì)胞核，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中METTL1蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞；在正常腦組織，METTL1蛋白在正常膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元細(xì)胞均有表達(dá)。比較發(fā)現(xiàn)， METTL1在膠質(zhì)瘤組織中的陽性表達(dá)率為50%（27/54），明顯高于正常腦組織中的膠質(zhì)細(xì)胞0%（0/10） ( χ2=8.649，P=0.0033，圖5)。

圖5 METTL1水平在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及正常腦組織中的差異Fig. 5 Difference of METTL1 levels between normal brain tissue and glioblastoma tissue

4 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤METTL1表達(dá)水平與患者臨床病理特征無明顯相關(guān)

54例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均年齡為52.5歲，腫瘤平均體積為32.8 cm3，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)METTL1水平與患者性別、年齡、腫瘤體積、發(fā)病部位及病灶的原/復(fù)發(fā)性質(zhì)無明顯相關(guān)性（表1）。TCGA數(shù)據(jù)庫TCGA Glioblastoma（GBM）收錄的167例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中有166例有總體生存隨訪數(shù)據(jù)，死亡133例，存活33例，隨訪時間5～2681天。取METTL1 mRNA表達(dá)較高的55例為高表達(dá)組，較低的55例為低表達(dá)組。METTL1高表達(dá)組死亡47例，存活8例，中位生存時間394 d；METTL1低表達(dá)組死亡43例，存活12例，中位生存時間333 d。繪制生存曲線，分析顯示METTL1 mRNA表達(dá)與患者預(yù)后生存時間之間無相關(guān)性（P=0. 296）（圖 6）。

表1 METTL1蛋白表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者臨床病理特征的關(guān)系Tab. 1 Relationship between METTL1 levels and clinicopathological features of patients with glioblastoma

圖6 METTL1 mRNA水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后的生存曲線Fig. 6 METTL1 mRNA levels and survival curves of patients with glioblastoma

5 METTL1敲除抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖與細(xì)胞活力

門戶網(wǎng)站Depmap收錄了阿喀琉斯項(xiàng)目根據(jù)35種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除METTL1表達(dá)后的增殖能力和細(xì)胞活力變化得出的Chronos依賴度評分。分析可見，35種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系針對METTL1的Chronos依賴度評分均低于0，提示METTL1的敲除可以不同程度地抑制各種細(xì)胞系來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖與活力。而對于Chronos依賴度評分低于-1分的細(xì)胞系U343，LN340，YKG1及LN428，METTL1很有可能是其生存的關(guān)鍵基因（圖7）

圖7 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系對METTL1表達(dá)依賴性分析。Chronos依賴度評分基于細(xì)胞CRISPR/Cas9技術(shù)基因敲除實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。越低的分值意味著越高的關(guān)鍵基因可能性。0分預(yù)示著基因不是關(guān)鍵基因，而-1分是所有泛關(guān)鍵基因的中位分值。Fig. 7 Dependence of METTL1 expression on glioblastoma cell lines. Chronos dependence score was based on data from cell CRISPR/Cas9 knockout assay. The lower the score， the higher the likelihood of an essential gene. A score of 0 indicates that a gene is not a critical gene， while -1 is the median score for all pan-essential genes.

討 論

甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要機(jī)制之一，通過催化甲基基團(tuán)與DNA、組蛋白、RNA等遺傳大分子結(jié)合，動態(tài)地維持基因組信息遺傳與表達(dá)的穩(wěn)定，影響細(xì)胞的分化與發(fā)展[4]。METTL1是一類正在被深入研究的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶，催化tRNA的N7甲基鳥苷（m7G）修飾，而tRNA是修飾程度最高的RNA，其表觀遺傳學(xué)調(diào)節(jié)的失衡與諸多腫瘤相關(guān)[9]。

近年來，METTL1與腫瘤的研究有了諸多進(jìn)展。METTL1與WD 重復(fù)結(jié)構(gòu)域 4 （WD Repeat Domain 4，WDR4）共同構(gòu)成甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，這兩個分子在多種惡性腫瘤的研究中被證明具有促癌效應(yīng)，并影響預(yù)后。研究表明肺癌樣本中，METTL1與WDR4的表達(dá)水平顯著增高，且與預(yù)后負(fù)相關(guān)，相關(guān)機(jī)制研究表明METTL1促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長與侵襲[5，10]。METTL1及WDR4在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的上調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)，機(jī)制實(shí)驗(yàn)證明該復(fù)合體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和進(jìn)展[6]。在肝癌、胃癌等惡性腫瘤中，METTL1也有類似的促癌效應(yīng)[7，11]。但在結(jié)腸癌組織中，METTL1低表達(dá)，且相關(guān)機(jī)制研究表明METTL1在結(jié)腸癌中呈現(xiàn)出抑癌的功能。METTL1對腫瘤的抗癌藥敏感性也有影響。在HeLa細(xì)胞系聯(lián)合敲低METTL1和NSUN可以顯著增加細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)METTL1可以增加其對順鉑的敏感性[13]。可以看出，在不同種類的腫瘤中，METTL1對腫瘤的發(fā)生發(fā)展及抗癌藥敏感性有著不同的影響，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。

近年來，METTL1與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的關(guān)系方面的研究主要在生物信息學(xué)分析預(yù)測方面[14-16]。Ping等通過對多維基因組數(shù)據(jù)分析，找到了一個包含了17個基因的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤核心基因模塊，其中METTL1是評分最高的相關(guān)基因，可以富集到多個腫瘤相關(guān)的功能及通路上[15]。Shruti Bhargava等通過qRT-PCR發(fā)現(xiàn)METTL1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，他們對數(shù)據(jù)庫的表達(dá)數(shù)據(jù)分析也表明，METTL1在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中高表達(dá)[16]。

本觀察中，免疫熒光染色顯示在正常腦組織中，作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤起源的星形膠質(zhì)細(xì)胞在非癌變狀態(tài)下，其核內(nèi)表達(dá)的METTL1蛋白水平明顯低于正常神經(jīng)元細(xì)胞。對TCGA數(shù)據(jù)庫的分析以及前述的相關(guān)研究背景表明，以癌變的星形膠質(zhì)細(xì)胞為主要成分的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中METTL1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于正常腦組織。本實(shí)驗(yàn)收集并研究了54例膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及10例正常腦組織，發(fā)現(xiàn)METTL1蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中明顯表達(dá)上調(diào)，提示METTL1蛋白高水平與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步的臨床病理參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，METTL1的高表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤體積、發(fā)病部位及病灶的原/復(fù)發(fā)性質(zhì)無明顯相關(guān)性，對TCGA數(shù)據(jù)庫生存隨訪數(shù)據(jù)的分析也表明，METTL1 mRNA表達(dá)水平的高低并不能用來預(yù)測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者生存時間的長短。

阿喀琉斯項(xiàng)目利用基于慢病毒的RNA干擾技術(shù)，或CRISPR-Cas9技術(shù)沉默或敲除個體基因進(jìn)行基因組尺度的基因功能缺失篩選，并應(yīng)用Chronos模型基于細(xì)胞增殖、細(xì)胞活力等參數(shù)計(jì)算CRISPR-Cas9技術(shù)產(chǎn)生的基因敲除效應(yīng)，并給出整合性Chronos依賴度評分[17]。越低的分值意味著越高的關(guān)鍵基因可能性。0分預(yù)示著基因不是關(guān)鍵基因，而-1分是所有泛關(guān)鍵基因的中位分值。該項(xiàng)目收錄的35種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系針對METTL1的Chronos依賴度評分均低于0，其中細(xì)胞系U343，LN340，YKG1及LN428對應(yīng)的評分均低于-1，提示METTL1的敲除可以不同程度地抑制各種細(xì)胞系來源的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖與活力，且可能是多種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存關(guān)鍵基因。

綜上所述，METTL1蛋白高水平表達(dá)與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的發(fā)生有關(guān)，降低其表達(dá)可以抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長水平，但其與患者臨床病理特征的關(guān)系有限，在預(yù)測患者生存及預(yù)后方面作用有限。