成 立，胡 良，劉 瑜，鐘智遙，樊后保，熊潤國，江栩昱，鄒云濤，王香蓮，胡盛明

(1 南昌工程學(xué)院江西省退化生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)與流域生態(tài)水文重點實驗室，江西 南昌 330099;2 江西生物科技職業(yè)學(xué)院， 江西 南昌 330200)

硒是人體內(nèi)必不可少的微量元素之一，具有重要的生物學(xué)功能。弄清硒的功能和生物效應(yīng)是闡明硒功能和毒理機(jī)制的一個關(guān)鍵因素。而硒的生物效應(yīng)、代謝行為和生物利用率在很大程度上取決于其具體化學(xué)形態(tài)，元素形態(tài)分析是對被分析物中實際存在的化學(xué)形式進(jìn)行識別和定量[1-2]。元素形態(tài)分析包括兩方面的技術(shù)，一是元素化學(xué)形式的分離方法，另一是檢測方法。近年來，高效液相色譜或電泳與高靈敏度的檢測器(比如ICP-MS)結(jié)合的聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)表明是最為有效的分析方法[ 3]。ICP-MS在硒形態(tài)分析中以靈敏度高，與其他色譜分離技術(shù)易結(jié)合，干擾少著稱，所以應(yīng)用最廣泛[4-5]。

環(huán)境和生物樣品中硒形態(tài)的定性和定量分析包括許多重要的步驟，這取決于樣品的基體組成，在分析過程中必須充分考慮這些因素。這些步驟包括：采樣、樣品儲存、樣品前處理(包括提取、基體分離、濃縮)、形態(tài)分離、測定(包括校正和定量)。每一步都有可能影響整個分析過程中的準(zhǔn)確性和對各形態(tài)的識別和鑒定，且每一步都需優(yōu)化、綜合考慮其他步驟以達(dá)到分析最佳化。

1 采樣和樣品提取方法

采樣方面包括收集、加工和處理，樣品分離方法的選擇取決于各方面的因素，比如分離和測定的的儀器，且更取決于待分析物的外觀形態(tài)和基體效應(yīng)以及樣品中可能出現(xiàn)的形態(tài)等等。硒形態(tài)分析應(yīng)用已逐漸從環(huán)境轉(zhuǎn)向了生物樣品，最大的挑戰(zhàn)就是盡可能從這些復(fù)雜的基體樣品中提取原始樣品形態(tài)且獲得高回收率。比如，硒氨基酸是水溶性酸，用熱水浸提法可獲得足夠的回收率。硒代氨基酸可通過超濾和透析而達(dá)到提取的目的。而硒代半胱氨酸和一些其他的硒氨基酸不穩(wěn)定易降解，需選擇更有效的提取方法，因為硒比硫在相對應(yīng)位置上有較低的氧化電勢電位。

2 分離方法

分離硒的化合物可通過色譜和電泳等分離方法完成。分離能力和與ICP-MS接口的兼容性是選擇分離方法的重要標(biāo)準(zhǔn)。對于小分子的無機(jī)硒、小分子代謝物、氨基酸或多肽化合物，反相色譜是最強(qiáng)大的分離方法。

2.1 排阻色譜

空間排阻色譜法適合分離大分子化合物，比如蛋白、高分子材料、肽鍵等[6]。鐵梅等利用體積排阻色譜檢測出了富硒金針菇中三種硒多糖，結(jié)果驗證了硒參與了生物大分子的合成，具有重要的生物活性[7]。肖俊超等采用體積排阻色譜分析了藻細(xì)胞中的三種硒結(jié)合形態(tài)，研究了硒脅迫對小球藻抗氧化酶活性的影響[8]。

2.2 離子交換色譜

離子交換色譜由待分析物的離子和流動相的離子與柱子上的固定相競爭結(jié)合而產(chǎn)生分離。離子交換色譜可以分離無機(jī)離子和任何易解離的物質(zhì)[9-10]。胡良等采用陰離子交換色譜法成功測定血清中的SeCys、SeMet、Se(IV)和Se(VI)等小分子硒形態(tài)，并應(yīng)用于研究長期汞暴露地區(qū)硒干預(yù)人群中血清的硒形態(tài)分析研究[9]。

2.3 反相色譜和反相離子對色譜

反相色譜是高效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的分離方法，色譜柱效高、分離能力強(qiáng)、保留機(jī)理清楚，一般是十八烷基、C18或C8辛基鏈結(jié)合某種固體材料、微孔硅膠材料。由于流動相是單極的，因此樣品被流動相和固定相分隔開。戊烷陰離子作為離子對試劑可分離三甲基硒離子、硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。通常情況下，反相離子對色譜與質(zhì)譜聯(lián)用時會帶來光譜或非光譜的干擾。首先，有機(jī)溶劑的使用會增加來自碳?xì)浠衔锏墓庾V方面的干擾，因為會增加背景信號。其次，梯度洗脫越來越普遍，但也會給ICP-MS帶來嚴(yán)重的基體干擾信號，所以定量分析變得越來越復(fù)雜。

2.4 親合色譜

親合色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用可以分析血清中常見蛋白(谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、Sel-P、Se-Albumin)的含量，親合色譜具有更好的效果，通過親合色譜微柱和低檢測限的ICP-MS聯(lián)用，優(yōu)化和改進(jìn)霧化器效率和流動相的組成，可以分析出微升級樣品中的硒蛋白P和硒的其它形態(tài)[11]。

2.5 電泳技術(shù)

電泳技術(shù)是基于離子的電泳淌度不同而實現(xiàn)分離的，它有區(qū)帶、等速電泳和等電子聚焦三種基本模式。它常用于分離相對穩(wěn)定的形態(tài)，分辨率高，一般和靈敏度極高的檢測器比如ICP-MS聯(lián)用[12]。黃峰等采用SDS-PAGE電泳技術(shù)實現(xiàn)了富硒螺旋藻中總蛋白的分離，并利用ICP-MS精測測定各分子量蛋白質(zhì)中的硒含量[13]。

2.6 多維分離方法

硒形態(tài)分析也可以先通過多維色譜分離純化后，再串聯(lián)質(zhì)譜對硒進(jìn)行定量分析。根據(jù)電荷大小及極性它們還可以通過陰離子交換色譜分離成更小的蛋白組分，而未分離的陽離子和不帶電的中性化合物需要進(jìn)一步通過陽離子交換色譜分離，通過二維或三維分離的化合物可通過四極桿或TOF質(zhì)譜測定[14-15]。

3 定量方法

3.1 色譜定量

色譜法是根據(jù)色譜峰的面積或高度進(jìn)行定量分析的。色譜定量計算方法很多，目前比較廣泛應(yīng)用的有歸一化法、內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。

3.2 ICP-MS定量測定硒形態(tài)

電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)具有靈敏度高、圖譜簡單、檢出限低、線性范圍寬，能同時進(jìn)行多元素分析和同位素分析的優(yōu)點。一般情況下，可通過用混合氣體(氙，氦等)，優(yōu)化調(diào)節(jié)質(zhì)譜條件(比如低壓，冷卻)或利用減少多原子離子干擾的提取鏡等方法，來使干擾降到最小。當(dāng)它用來作為色譜檢測器測量分離前的總硒時，多原子離子干擾不容易產(chǎn)生。研究表明，用甲烷作反應(yīng)氣，ICP-DRC-MS作為檢測器成功應(yīng)用于分析硒的六種同位素[16]。大約可以消除氬的五個數(shù)量級的干擾。因此可以通過檢測硒的主要同位素80Se來達(dá)到較高的靈敏度[16]。 ICP-MS 儀器經(jīng)歷了四極桿質(zhì)譜儀(ICP-QMS)、高分辨雙聚焦質(zhì)譜儀(HR-ICP-MS)和多接收高分辯雙聚焦質(zhì)譜儀(MC-ICP-MS)三個發(fā)展階段。其分離離子的方式有四極桿、飛行時間和扇形分析器等。飛行時間質(zhì)譜能夠很好的與GC和CE結(jié)合，且有著采集數(shù)據(jù)速度快的特點，所以它在形態(tài)分析應(yīng)用上有著潛在發(fā)展空間。用高分辨率質(zhì)譜和動態(tài)反應(yīng)池(碰撞池)可部分地消除多原子離子干擾。尤其在捕獲同位素的短暫信號方面，多接收器比單接收器能獲得更高的準(zhǔn)確度。為了得到更高的分辨率和減少多原子離子干擾，可應(yīng)用雙聚焦扇形質(zhì)譜，但增加分辨率的同時，也降低了靈敏度。在靈敏度和分辨率方面，只能妥協(xié)折中選擇，因為增加靈敏度的同時必會降低分辨率。

3.3 同位素稀釋法定量(Isotope dilution analysis(IDA))

根據(jù)加入同位素稀釋劑的形式，可以將同位素稀釋法分為特異示蹤模式和非特異示蹤模式。特異示蹤模式(Species-specific spike)是同位素稀釋劑與待測樣品先相互混勻后再進(jìn)行分離和檢測的。其應(yīng)用的前提是樣品中的形態(tài)和組成是已知的。非特異示蹤模式(Species-unspecific spike)，也叫柱后同位素稀釋法，首次于Rottman和 Heumann在1994年提出，在這種模式中，稀釋劑在待測物質(zhì)通過高效液相色譜分離后再和分離后的待測樣品的不同形態(tài)一起進(jìn)入電感耦合等離子體質(zhì)譜中進(jìn)行檢測。此后可得到待測元素的不同同位素的時間圖譜以及同位素比值圖譜，然后通過柱后同位素稀釋法公式可將每一時間點的待測元素比值換算成相對應(yīng)的時間質(zhì)量流譜圖。待測樣品中不同形態(tài)的濃度含量可通過先算出色譜圖中相應(yīng)峰的峰面積，再與進(jìn)樣量相比得到。

柱后同位素稀釋法方程是根據(jù)樣品和稀釋劑中待測元素混合前后質(zhì)量守恒推導(dǎo)得到的。即由公式Nm=Ns+NSp推算出，雖有文獻(xiàn)報道其它形式公式但其原理實質(zhì)是一樣的。其中影響準(zhǔn)確測量同位素比率的參數(shù)有光譜干擾、儀器的死時間和質(zhì)量歧視等；影響精確測量同位素比率的參數(shù)有離子計數(shù)統(tǒng)計、當(dāng)前待測離子的穩(wěn)定度和同位素稀釋法中隨機(jī)誤差的傳遞等。

柱后同位素稀釋法所加入的同位素稀釋劑的化學(xué)形態(tài)與被分析物種不同。這種測定模式的優(yōu)點是可以對未知結(jié)構(gòu)化合物進(jìn)行形態(tài)分析，能夠準(zhǔn)確測定樣品中存在的未知化合物的濃度[17]。這是其他定量方法，比如標(biāo)準(zhǔn)加入法所無法比擬的，因為加入的元素形態(tài)與被分析的元素形態(tài)往往是不能完全一致的，所以它們的化學(xué)性質(zhì)也不會相同。由于ICP-MS的離子源的離子化效率與元素存在的形態(tài)無關(guān)，因此非特異示蹤模式經(jīng)常與ICP-MS聯(lián)用來測定各種化合物的濃度[18]。由于硒在人體組織、器官、體液中的作用機(jī)理、代謝規(guī)律還未完全闡述清楚。故有不少分析工作者長期致力于硒形態(tài)分析的研究，近幾年來，有較多篇文獻(xiàn)報道采用柱后同位素稀釋法分析GPx, Sel-P, Albumin中的硒含量，以揭示生物體內(nèi)不同含硒蛋白中硒元素的分布規(guī)律[11]。

4 結(jié) 語

在未來的幾年，硒形態(tài)分析的重要性仍然會快速發(fā)展。ICP-MS作為檢測方法與HPLC、GC和CE聯(lián)用因靈敏度高、檢則限低必然是首選。最后，進(jìn)一步鑒別各種不同樣品中更多硒的形態(tài)將面臨更大挑戰(zhàn)。為得到更精切的硒蛋白和硒化合物信息，比ICP-MS更靈敏的類似分析技術(shù)也將會快速發(fā)展成熟。類似電噴霧和表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在硒形態(tài)分析中將得到更好的應(yīng)用與發(fā)展。金屬蛋白組學(xué)領(lǐng)域的生物無機(jī)形態(tài)分析也是一個重點討論的話題，在硒形態(tài)分析研究中也將成為熱點。