肖生鴻，鄧倩儀，黃潔婷，賴(lài)少娟，黃真池

(嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048)

近年來(lái)，土壤重金屬污染日趨嚴(yán)重，重金屬對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注[1]。重金屬脅迫引起植物細(xì)胞中保護(hù)酶的活性和抗氧化劑含量的改變，如超氧化物歧化酶(SOD)，過(guò)氧化氫酶(CAT)，過(guò)氧化物酶(POD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)等活性的改變和還原型谷胱甘肽(GSH)、苯丙氨酸等含量的變化[2]，打破活性氧(reactive oxygen species ,ROS)代謝平衡，引起ROS大量爆發(fā)[3]。脅迫條件下植物的抗氧化能力升高可增強(qiáng)重金屬抗性[4]。逆境下植物的基因表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，啟動(dòng)或加強(qiáng)與逆境相適應(yīng)的基因表達(dá)，合成脅迫蛋白以增強(qiáng)抗性[5]。

地殼中Hg2+的平均含量為0.08 mg/kg，我國(guó)南方土壤Hg2+含量較低，一般非污染土壤表土含Hg2+不超過(guò)0.04 mg/kg，但受污染的土壤中Hg2+含量可能高得多[6]。Hg2+是植物的非必需元素，具有持久性、易遷移性、高度的生物富集性、強(qiáng)毒性等特性。當(dāng)濃度超過(guò)防御體系的飽和程度后，汞離子會(huì)通過(guò)不同途徑干擾和破壞細(xì)胞的正常代謝[7]，改變生理生化進(jìn)程，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育。

桉樹(shù)屬桃金娘科(Myrtaceae)，包括杯果木屬(Angophora)、傘房屬(Corymbia)和桉樹(shù)屬(Eucalyptus)[8]。桉樹(shù)具有耐干旱和瘦瘠，輪伐期短，用途廣泛，經(jīng)濟(jì)效益高等諸多優(yōu)點(diǎn)，被公認(rèn)為三大人工林樹(shù)種之一[9]。據(jù)國(guó)家林草局第九次全國(guó)森林資源清查結(jié)果，截至2018年，全國(guó)桉樹(shù)面積為546萬(wàn)hm2。我國(guó)年產(chǎn)桉樹(shù)木材3 000萬(wàn)m3以上，被廣泛用做鋸材、膠合板材、造船材和紙漿材等[10-11]。桉樹(shù)產(chǎn)業(yè)在維護(hù)國(guó)家木材安全，促進(jìn)國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展，發(fā)揮生態(tài)防護(hù)作用，幫助農(nóng)村脫貧致富等方面貢獻(xiàn)巨大。

隨著桉樹(shù)木材需求的不斷增加，桉樹(shù)栽種面積需更快地?cái)U(kuò)大。但桉樹(shù)起源于熱帶，大部分樹(shù)種不能承受我國(guó)長(zhǎng)江以北的低溫環(huán)境[12]。我國(guó)南方省份礦區(qū)的重金屬污染形勢(shì)嚴(yán)峻，主要是Cd、Pb、As、Cr、Hg等重金屬污染，生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)嚴(yán)重[13]。研究重金屬脅迫對(duì)桉樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的影響和相關(guān)機(jī)理，可為在我國(guó)南方重金屬污染礦區(qū)栽種桉樹(shù)復(fù)綠和生態(tài)修復(fù)提供參考。目前已有學(xué)者對(duì)桉樹(shù)在重金屬脅迫下的表面毒性效應(yīng)、耐性機(jī)制等研究上作了相關(guān)的探討。游秀花等[14]報(bào)道，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Cu、Zn、Cd對(duì)我國(guó)南方重要造林樹(shù)種鄧恩桉、本沁桉、巨桉與直桿藍(lán)桉的種子發(fā)芽與根伸長(zhǎng)均存在抑制效應(yīng)。韋月越等[15]研究發(fā)現(xiàn)，根部的滯留作用、根部的吸收限制、細(xì)胞壁固持作用及可溶組分的區(qū)隔化作用，是桉樹(shù)耐受污染土壤中Cu和Cd的主要機(jī)制。但有關(guān)汞脅迫對(duì)桉樹(shù)生長(zhǎng)代謝影響的研究鮮有報(bào)道。本研究探討汞脅迫對(duì)桉樹(shù)保護(hù)酶活性及基因表達(dá)的影響，旨在為桉樹(shù)重金屬抗性生理的研究積累資料。

1 材料與方法

廣林9號(hào)桉(GL9:Eucalyptusgrandis×Eucalyptusurophylla)3月齡的無(wú)性系幼苗，栽種于250 mL輕型基質(zhì)(泥炭土∶蛭石=1∶1)，緩苗5 d期間澆透1 g/L復(fù)合肥。緩苗后取長(zhǎng)勢(shì)基本一致的盆栽苗，隨機(jī)分為3組，每組12盆，每天早晚用50 mL HgCl2溶液澆灌處理，濃度分別為25、50、75 μmol/L，對(duì)應(yīng)低、中、高濃度。對(duì)照組(CK)澆等量自來(lái)水。澆灌處理15 d后測(cè)量株高并采集自頂芽下第4片展開(kāi)的成熟葉片，去中脈后用于生理指標(biāo)測(cè)定。

葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定：隨機(jī)在同組植株中的4株任取1片自頂芽下第4片展開(kāi)的成熟葉片，去中脈，等質(zhì)量混合并剪成細(xì)絲。稱(chēng)取100 mg細(xì)絲置于具塞試管，加10 mL 95%乙醇，暗處26℃浸泡24 h。測(cè)A649、A665，將值代入公式Cchl(mg/L)=6.63A665+18.08A649計(jì)算葉綠素濃度，求出葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

酶活性測(cè)定：稱(chēng)取0.2 g葉片(每個(gè)處理3次重復(fù))，加100 mg PVPP，4 mL酶提取液(50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L β-巰基乙醇)，冰浴勻漿后，將勻漿液4℃，8 000 r/min離心10 min，所得上清即為粗酶液。POD活性，CAT活性，GPX活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]的方法，MDA質(zhì)量摩爾濃度的測(cè)定采用硫代巴比妥酸顯色法[17]。

RNA提取和反轉(zhuǎn)錄：稱(chēng)取50 mg的去中脈葉片，于液氮中研磨至細(xì)粉，加入1 mL RNAiso-mate for Plant Tissue勻漿。按RNAiso Plus試劑說(shuō)明書(shū)步驟提取總RNA，并用Nanodrop 2000c檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。反轉(zhuǎn)錄按文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行，得到初始cDNA，備用。所有試劑均是寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

目的基因選擇及引物設(shè)計(jì)：根據(jù)The RedoxiBase (http://peroxibase.toulouse.inra.fr/)和Phytozome 12(https://phytozome.jgi.doe.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中POD、CAT、GPX3類(lèi)保護(hù)酶基因的序列，用Primer3plus軟件設(shè)計(jì)qPCR引物。經(jīng)qPCR預(yù)試驗(yàn)從POD、CAT、GPX3類(lèi)基因中篩選出9個(gè)(每類(lèi)3個(gè))特異性好，擴(kuò)增效率高的基因作目的基因。內(nèi)參基因RTEF和3類(lèi)9個(gè)保護(hù)酶基因的編號(hào)和引物序列見(jiàn)表1。

qPCR擴(kuò)增：qPCR反應(yīng)儀器為CFX-96 Touch (Bio-Rad)；反應(yīng)體系25 μL，分別是SYBR PremixTaqTMⅡ 12.5 μL，10 μmol/L Primer F和Primer R各1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL。按文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行qPCR。用2-ΔΔCt法[19]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 內(nèi)參基因和3類(lèi)9個(gè)保護(hù)酶基因的編號(hào)和引物序列Table 1 Number and primer sequence of internal reference gene and three types of nine protective enzyme genes

2 結(jié)果與分析

2.1 Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉株高、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量和3種保護(hù)酶活性變化

Hg2+脅迫下，廣林9號(hào)桉株高略有下降，葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯，各濃度處理與對(duì)照間均無(wú)顯著性差異。隨著Hg2+濃度增大，廣林9號(hào)桉MDA含量明顯升高(表2)。75 μmol/L Hg2+處理后MDA含量高達(dá)27.88 nmol/g，是50 μmol/L Hg2+處理后MDA含量的2.3倍，是對(duì)照的3.35倍。Hg2+脅迫影響廣林9號(hào)桉保護(hù)酶的活性(表2)。與對(duì)照相比：不同濃度Hg2+處理后的廣林9號(hào)桉GPX活性均降低；POD活性變化無(wú)顯著差異，呈低濃度下活性升高，高濃度時(shí)活性降低的趨勢(shì)；50 μmol/L Hg2+處理后，CAT活性降低，為對(duì)照的80.10%。表2結(jié)果說(shuō)明汞脅迫對(duì)桉樹(shù)植株生理指標(biāo)的影響與濃度有關(guān)，不同種類(lèi)的保護(hù)酶活性受Hg2+脅迫的影響不盡相同。Hg2+脅迫影響保護(hù)酶活性，打破ROS代謝平衡，引起膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA積累。

表2 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉株高、葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、MDA含量和3種保護(hù)酶活性變化Table 2 Changes of plant height,chlorophyll content,MDA content and three protective enzymes activities of GL9 under the stress of different Hg2+concentrations

2.2 Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉POD類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化

Hg2+脅迫下，POD1基因的轉(zhuǎn)錄被顯著抑制(表3)。隨Hg2+脅迫強(qiáng)度的增加，POD2轉(zhuǎn)錄水平呈先下降后上升的趨勢(shì)。低、中、高濃度Hg2+脅迫下，POD3基因?qū)?yīng)的相對(duì)表達(dá)量分別為6.81、3.19、2.31。隨著濃度增大，Hg2+對(duì)POD3基因誘導(dǎo)表達(dá)作用減弱，反映Hg2+濃度越大，毒害作用越大。Hg2+脅迫下不同POD基因的轉(zhuǎn)錄變化不同可能與基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的定位及主要生理作用有關(guān)。

表3 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉3個(gè)POD基因轉(zhuǎn)錄水平變化Table 3 Transcriptional level changes of three POD genes of GL9 under the stress of different Hg2+ concentrations

2.3 Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉CAT類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化

Hg2+脅迫下，CAT1基因和CAT3基因的轉(zhuǎn)錄被顯著抑制，且表現(xiàn)為Hg2+濃度增大，抑制作用增強(qiáng)(表4)，進(jìn)一步說(shuō)明Hg2+毒性強(qiáng)弱與濃度密切相關(guān)。Hg2+脅迫增強(qiáng)了CAT2基因的轉(zhuǎn)錄，但隨著Hg2+濃度增大，誘導(dǎo)作用減弱。CAT2基因的轉(zhuǎn)錄水平升高有利于CAT酶活性的升高，減少汞脅迫引起的H2O2積累，減輕膜脂過(guò)氧化的傷害。

表4 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉3個(gè)CAT基因轉(zhuǎn)錄水平變化Table 4 Transcriptional level changes of three CAT genes of GL9 under the stress of different Hg2+ concentrations

2.4 Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉GPX類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化

低濃度Hg2+處理誘導(dǎo)GPX1和GPX2的轉(zhuǎn)錄水平升高。當(dāng)Hg2+濃度升高到50 μmol/L或75 μmol/L時(shí)，毒性增強(qiáng)，對(duì)GPX1基因的誘導(dǎo)作用減弱，對(duì)GPX2基因的轉(zhuǎn)錄表現(xiàn)為抑制。用低，中，高濃度的Hg2+處理后，均明顯抑制了GPX3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量分別為0.14、0.07、0.05(表5)。GPX類(lèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平與Hg2+濃度密切相關(guān)，不同Hg2+濃度下基因表達(dá)變化與酶活性變化相同。試驗(yàn)檢測(cè)的9個(gè)基因中，GPX3基因的轉(zhuǎn)錄受汞脅迫的抑制最顯著。其相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平高低可作為評(píng)估桉樹(shù)受汞脅迫毒害程度的重要參考。Hg2+脅迫下GPX3基因表達(dá)變化程度也可作為篩選Hg2+脅迫耐受品種的指標(biāo)。

表5 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號(hào)桉3個(gè)GPX基因轉(zhuǎn)錄水平變化Table 5 Transcriptional level changes of three GPX genes of GL9 under the stress of different Hg2+ concentrations

3 結(jié)論與討論

Hg2+是毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，有較高的擴(kuò)散性和脂溶性，能改變細(xì)胞膜的透性，對(duì)蛋白質(zhì)的巰基、核酸中的磷酸基具有高親和力。當(dāng)植物體內(nèi)汞積累到一定程度后，就會(huì)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，抑制酶的活性，影響蛋白質(zhì)合成，對(duì)植物細(xì)胞的生理活動(dòng)和生化反應(yīng)造成傷害[20-21]。

MDA是膜脂過(guò)氧化作用的重要產(chǎn)物之一，是反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度的重要指標(biāo)[22]。當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，質(zhì)膜的組成和完整性遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，引起膜質(zhì)的過(guò)氧化，使得MDA的含量大幅度地上升。為了減輕ROS傷害，植物體內(nèi)應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)作用，激活抗氧化系統(tǒng)。因此在一定程度上MDA含量的高低可以表示植物體內(nèi)自由基的量態(tài)和植物對(duì)逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)度[23]。本研究表明，Hg2+脅迫可以促進(jìn)MDA的產(chǎn)生，且隨著處理濃度的增加，MDA含量的上升幅度越大。高濃度Hg2+處理后，MDA含量高達(dá)27.88 nmol/g，是對(duì)照的3.35倍，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的自由基積累量增多，膜脂過(guò)氧化作用增強(qiáng)，生物膜結(jié)構(gòu)受到損傷。

Hg2+脅迫影響基因的表達(dá)。Hedenreich 等[28]發(fā)現(xiàn)Hg2+誘導(dǎo)的編碼蛋白質(zhì)的基因參與葉綠素合成、細(xì)胞壁代謝、P450介導(dǎo)的次生代謝物的生物合成。水稻中過(guò)表達(dá)OsTCTP基因增強(qiáng)了抗氧化酶的活性，降低Hg2+誘導(dǎo)的活性氧，從而減輕ROS的傷害，提高水稻對(duì)Hg2+脅迫的耐受性；敲除OsTCTP基因則有相反的結(jié)果[29]。汞脅迫下豌豆根中POD基因明顯上調(diào)[30]。本研究中，POD3、CAT2和GPX1的轉(zhuǎn)錄均上調(diào)。在逆境下，植物的抗氧化酶含量因氧化損傷而減少，通過(guò)誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，可以緩解脅迫造成的傷害。低濃度Hg2+處理后POD3、CAT2、GPX1的相對(duì)表達(dá)量分別為6.81、4.58和2.56；高濃度Hg2+處理后POD3，CAT2，GPX1的相對(duì)表達(dá)量分別為2.31、2.02和1.08，表明低濃度下的基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)更顯著。低濃度Hg2+誘導(dǎo)累積的少量活性氧可能作為細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)答，誘導(dǎo)POD3、CAT2、GPX1的應(yīng)激性轉(zhuǎn)錄上調(diào)，維持活性氧代謝平衡，減輕Hg2+毒害。但在高濃度的Hg2+脅迫下，抗氧化系統(tǒng)無(wú)法清除由Hg2+脅迫引起的嚴(yán)重氧化應(yīng)激，活性氧積累過(guò)多，導(dǎo)致抗氧化系統(tǒng)受損，從而不同程度地降低抗氧化酶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平[31]。Hg2+脅迫使廣林9號(hào)桉的其他6個(gè)保護(hù)酶基因轉(zhuǎn)錄總體呈下調(diào)趨勢(shì)，但也表現(xiàn)為低濃度處理高于高濃度處理。

Hg2+脅迫影響保護(hù)酶活性，打破ROS代謝平衡，引起膜脂過(guò)氧化，導(dǎo)致MDA積累。POD、CAT、GPX 3類(lèi)保護(hù)酶活性受Hg2+脅迫的影響不盡相同。Hg2+脅迫下保護(hù)酶基因的表達(dá)變化各不相同。檢測(cè)的9個(gè)基因中，6個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄受Hg2+脅迫抑制，POD3、CAT2、GPX1 3個(gè)基因受Hg2+脅迫誘導(dǎo)，且均表現(xiàn)出隨Hg2+濃度增大誘導(dǎo)作用減弱的趨勢(shì)。Hg2+脅迫對(duì)GPX3基因轉(zhuǎn)錄的抑制最顯著，檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平可評(píng)估毒害程度，或作為篩選汞脅迫耐受品種的指標(biāo)。本試驗(yàn)為桉樹(shù)重金屬抗性生理的研究積累了資料，可為在我國(guó)南方重金屬污染礦區(qū)栽種桉樹(shù)復(fù)綠和生態(tài)修復(fù)提供參考。