潘一鳴 李蕊白 黃子明 王 婧 馬 薇 陳信義 侯 麗

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

急性髓系白血?。ˋML）是起源于造血干祖細(xì)胞的惡性克隆性疾病，占成人急性白血病的80%，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、出血、貧血和白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，起病較急，自然病程僅3個(gè)月左右［1］。雖然化療、支持治療和造血干細(xì)胞移植（HSCT）的進(jìn)步改善了AML的預(yù)后，但60歲以下成人AML的5年生存率仍只有30%～40%，高齡患者更低［2］。尋找新的治療方法和藥物意義重大。丹參是治療AML的常用中藥，其主要有效成分丹參酮Ⅱa具有良好的抗腫瘤活性，但丹參酮Ⅱa在AML中的作用和機(jī)制研究尚不充分，本研究通過AML細(xì)胞HL-60探究丹參酮Ⅱa體外抗白血病的效應(yīng)和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試藥與儀器 丹參酮Ⅱa（貨號(hào)HY-N0135，批號(hào)28232）、巴弗洛霉素A1（貨號(hào)HY-100558，批號(hào)81280）由MedChemExpress公司生產(chǎn)。IMDM培養(yǎng)基（貨號(hào)12440061）、青鏈霉素（貨號(hào)15140122）、胎牛血清（貨號(hào)10099141）由Gibco公司生產(chǎn)。CCK-8細(xì)胞增殖-毒性試劑盒（Cell Counting Kit-8，貨號(hào)CK04）由日本同仁公司生產(chǎn)。吉姆薩染液（貨號(hào)G1015）為Solarbio公司生產(chǎn)。一抗Caspase-3（貨號(hào)ab32351）、PARP-1（貨號(hào)ab191217）、LC3B（貨號(hào) ab192890）、p-AMPK（貨號(hào)ab194920）、p-mTOR（貨號(hào) ab109268）、β-actin（貨號(hào)ab8226）抗體由Abcam公司生產(chǎn)。辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（貨號(hào)A0208、A0216）由碧云天公司生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)FormaTMSeries 3 Water Jacketed CO2Incubator）為Thermo公司產(chǎn)品。細(xì)胞光學(xué)顯微鏡（型號(hào)DM750）為萊卡公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀（型號(hào)SpectraMax M5）為BioTek Instrments公司產(chǎn)品。蛋白電泳儀（型號(hào)Mini-PROTEAN Tetra）為伯樂公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞 急性髓系白血病細(xì)胞HL-60由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫所提供，以含20%胎牛血清、1%青鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，2～3 d換液。

1.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力及增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，設(shè) 0（對(duì)照組）、1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L丹參酮Ⅱa組，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板后加藥處理24 h和48 h，并另設(shè)僅含培養(yǎng)基的空白組。處理完畢后加入CCK-8各10 μL培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光度值（OD），計(jì)算增殖抑制率和細(xì)胞存活率。將增殖抑制率數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 7.00行非線性回歸擬合獲得IC50。結(jié)合24 h組IC50結(jié)果，設(shè)丹參酮Ⅱa 0 μmol/L+巴弗洛霉素A1 0 nmol/L組，巴弗洛霉素A1 20 nmol/L組，丹參酮Ⅱa 32 μmol/L組，丹參酮Ⅱa 32μmol/L+巴弗洛霉素A1 20 nmol/L組，予相應(yīng)處理24 h后CCK-8法測(cè)細(xì)胞存活率。

1.4 吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài) 丹參酮Ⅱa處理HL-60細(xì)胞24 h后，制成細(xì)胞涂片，甲醇固定，吉姆薩染片15 min后自來水沖洗，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5 Western blotting檢測(cè)凋亡與自噬相關(guān)因子水平細(xì)胞經(jīng)處理后以1×磷酸緩沖鹽溶液洗滌2次，冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白，制樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉3 h，裁膜，一抗4℃過夜，二抗孵育1 h，曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料以（±s）表示。經(jīng)正態(tài)檢驗(yàn)后，正態(tài)數(shù)據(jù)間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HL-60增殖抑制率比較 隨著丹參酮Ⅱ濃度升高，抑制HL-60作用增強(qiáng)，48 h效果強(qiáng)于24 h，見表1。行非線性回歸擬合，得24、48 h丹參酮Ⅱ的IC50分別為 32.87、18.4 μmol/L，見表 1。分別取 0、16、32、64 μmol/L行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60增殖抑制率影響（%，±s）

表1 丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60增殖抑制率影響（%，±s）

丹參酮Ⅱa（μmol/L）24 h 48 h 1 2 4 8 16 32 64 128 4.38±2.14 6.47±1.81 8.29±3.54 16.30±3.78 32.57±8.07 48.87±3.77 68.20±3.05 80.37±2.16 9.14±1.69 13.63±4.25 19.84±2.20 29.45±3.04 41.02±4.72 62.68±2.64 79.13±1.92 93.42±1.17

2.2 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60細(xì)胞形態(tài)的影響光鏡下觀察HL-60細(xì)胞，丹參酮Ⅱa 0μmol/L組細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核大小均一；16 μmol/L組細(xì)胞核縮小，形態(tài)不均一，可見核固縮深染、含凋亡小體的凋亡細(xì)胞；32 μmol/L組凋亡細(xì)胞顯著增加；64μmol/L組鏡下見大量凋亡細(xì)胞和破碎細(xì)胞。見圖1。

圖1 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60細(xì)胞形態(tài)影響（吉姆薩染色，400倍）

2.3 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60凋亡因子水平的影響 隨著丹參酮Ⅱa濃度的升高，Caspase-3減少，Cleaved-Caspase-3增多，PARP-1切割增多，見圖2。行定量分析得各組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。表明丹參酮Ⅱa以濃度依賴的方式誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。

圖2 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60凋亡因子水平的影響

表2 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60凋亡因子影響的相對(duì)灰度值定量分析（±s）

表2 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60凋亡因子影響的相對(duì)灰度值定量分析（±s）

注：與0 μmol/L比較，*P＜0.05。下同。

凋亡因子Caspase-3 Cleaved-Caspase-3 Cleaved-PARP-1 n 3 3 3 0 μmol/L 1.03±0.08 0.23±0.02 0.35±0.05 16 μmol/L 0.83±0.05*0.29±0.02*0.59±0.06*32 μmol/L 0.64±0.01*0.38±0.02*0.76±0.03*64 μmol/L 0.53±0.06*0.78±0.03*0.92±0.05*

2.4 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60自噬因子水平的影響 隨著丹參酮Ⅱa濃度上升，p-AMPK、LC3B水平上升，p-mTOR水平下降，表明AMPK/mTOR通路和自噬被激活，見圖3。定量分析得各組較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。表明丹參酮Ⅱa以濃度依賴的方式激活A(yù)MPK/mTOR通路，誘導(dǎo)HL-60自噬。

表3 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60自噬因子影響的相對(duì)灰度值定量分析（±s）

表3 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60自噬因子影響的相對(duì)灰度值定量分析（±s）

凋亡因子p-AMPK p-mTOR LC3B n 3 3 3 0 μmol/L 0.13±0.02 1.03±0.06 0.12±0.02 16 μmol/L 0.52±0.02*0.49±0.02*0.41±0.03*32 μmol/L 0.78±0.03*0.40±0.02*0.65±0.03*64 μmol/L 1.10±0.01*0.23±0.04*1.08±0.07*

圖3 不同濃度丹參酮Ⅱa對(duì)HL-60自噬因子表達(dá)量的影響

2.5 不同濃度丹參酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1對(duì)HL-60細(xì)胞存活率的影響 丹參酮Ⅱa 32 μmol/L組存活率降至（51.21±2.36）%，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與巴弗洛霉素A1聯(lián)用后存活率恢復(fù)至（76.82±3.05）%，與丹參酮Ⅱa 32μmol/L組對(duì)比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。丹參酮Ⅱa誘導(dǎo)HL-60凋亡的作用被巴弗洛霉素A1部分抑制，表明自噬發(fā)揮了促凋亡作用。

表4 不同濃度丹參酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1對(duì)HL-60細(xì)胞存活率的影響（±s）

表4 不同濃度丹參酮Ⅱa和巴弗洛霉素A1對(duì)HL-60細(xì)胞存活率的影響（±s）

注：與丹參酮Ⅱa 0 μmol/L+巴弗洛霉素A1 0 μmol/L組比較，△P＜0.05。

24 h細(xì)胞存活率（%）100.00±0.91 98.44±3.53 51.21±2.36△76.82±3.05△丹參酮Ⅱa（μmol/L）0 03 2 32巴弗洛霉素A1（nmol/L）0 20 0 20

3 討 論

目前AML治療主要依賴化療和HSCT，雖然化療使超過80%的年輕患者完全緩解，但5年總生存率不到40%［3］。此外化療會(huì)導(dǎo)致骨髓抑制，引起出血和感染［4］。而HSCT要考慮禁忌證、費(fèi)用、配型、移植物抗宿主病等問題［5-7］。以砒霜為代表的中醫(yī)藥在AML治療中有許多成功的應(yīng)用，繼續(xù)深化相關(guān)研究意義重大［8］。痰瘀互阻是急性白血病的主要病因病機(jī)，治以“化痰散結(jié)、活血祛瘀”之法可以延長(zhǎng)患者生存期，提高臨床療效［9-12］。丹參味苦性微寒，能補(bǔ)血活血祛瘀，涼血清心消癰，有“一味丹參，功同四物”之說?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其所含的丹參酮Ⅱa可抑制肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤生長(zhǎng)［13］。本研究中，丹參酮Ⅱa可以抑制HL-60增殖，增加Caspase-3和PARP-1切割，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡，效果呈時(shí)間和濃度依賴性。此外丹參酮Ⅱa會(huì)激活A(yù)MPK/mTOR通路引發(fā)自噬，聯(lián)用自噬抑制劑巴弗洛霉素A1會(huì)弱化丹參酮Ⅱa的抗白血病作用，表明激活自噬強(qiáng)化了其抗白血病作用。

自噬異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［14-15］。應(yīng)激壓力下腫瘤細(xì)胞通過自噬來保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［16］，但過度自噬引發(fā)自噬性死亡，常與凋亡相伴發(fā)［17］。對(duì)于AML，自噬相關(guān)蛋白較正常成熟粒細(xì)胞呈低表達(dá)［18］。小鼠敲除ATG7、ATG8后發(fā)生白血?。?9］。AMPK/mTOR通路是調(diào)控能量代謝的重要通路，該通路激活會(huì)促進(jìn)分解代謝（自噬）增加能量供給［20］。腫瘤細(xì)胞活性氧水平更接近氧化損傷的閾值，AMPK/mTOR激活后引發(fā)自噬進(jìn)行分解代謝，產(chǎn)能增加，活性氧累積，氧化應(yīng)激活化Caspase系統(tǒng)，最終Caspase-3轉(zhuǎn)為Cleaved-Cas?pase-3，切割PARP-1等生物大分子，使腫瘤細(xì)胞死亡［21-22］。

綜上所述，丹參酮Ⅱa通過誘導(dǎo)HL-60凋亡和自噬發(fā)揮抗白血病作用，AMPK/mTOR可能是介導(dǎo)這一效應(yīng)的重要信號(hào)通路，值得進(jìn)一步深入研究。