王 玨 孫麗麗 陳 璐 李竹英△

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘）是一種發(fā)病率較高的呼吸系統(tǒng)慢性炎癥反應(yīng)性疾病。有研究顯示，目前全世界有哮喘患者約1.5～2億人，在我國(guó)，14歲以上人群支氣管哮喘總體患病率為1.24%，大約有2 000萬(wàn)的哮喘患者，患病率呈明顯上升趨勢(shì)［1］。平喘顆粒為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科治療哮喘的經(jīng)驗(yàn)方化裁而來(lái)，在改善患者臨床癥狀及肺功能，減少哮喘再發(fā)，減輕再發(fā)時(shí)癥狀，提高哮喘患者免疫力等方面有良好療效［2-3］。miR-21存在多種疾病中，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在哮喘大鼠模型中表達(dá)顯著［4］，在哮喘發(fā)病中有重要調(diào)節(jié)作用。前期研究顯示［5］，平喘顆?？山档拖笫驟OS水平。因此推測(cè)平喘顆粒可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)降低Eotaxin及EOS水平，減輕氣道炎癥，從而起到治療作用。本研究通過(guò)抑制miR-21的表達(dá)，觀察肺泡灌洗液（BALF）及外周血中細(xì)胞EOS計(jì)數(shù)及Eotaxin mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步探討平喘顆?？赡芙档虴OS的機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雌性Wistar大鼠，清潔級(jí)，120只，體質(zhì)量（200±20）g，由依托單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（黑）2008-004，使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2014-002。動(dòng)物飼料由依托單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)室溫度18～25℃，相對(duì)濕度40%～75%。

1.2 試藥與儀器 1）藥物。平喘顆粒：淫羊藿200 g，炙麻黃100 g，太子參150 g，黃芪150 g，五味子 150 g，款冬花150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g，知母100 g。加水煎煮2次，每次2 h，濾過(guò)，取上清液回收乙醇并濃縮至稠膏，加入蔗糖、糊精適量，混勻，制成顆粒，干燥，最終質(zhì)量1 000 g（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制備，批號(hào)20150102）。2）試劑。卵蛋白（OVA，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)AP0028），Real-time PCR試劑盒（瑞士Roche公司，批號(hào)0491391400），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)J20519），miR-21抑制劑（美國(guó)Ambion公司，批號(hào)AM10206），miR-21陰性對(duì)照（美國(guó)Ambion公司，批號(hào)AM17010）。3）儀器。自制霧化箱（40 cm×35 cm×25 cm），肺功能儀（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供），超聲霧化器（江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備有限公司），PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad公司），實(shí)時(shí)定量PCR儀美國(guó)Agilent公司，Image Pro Plus6.0圖像分析軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司），全自動(dòng)五類(lèi)血液分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特股份有限公司）。

1.3 分組與造模 Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、miR-21抑制表達(dá)組、miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組、miR-21抑制表達(dá)+中藥組、中藥組，每組20只。正常組不做任何處理；模型組、miR-21抑制表達(dá)組、miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組、miR-21抑制表達(dá)+中藥組、中藥組造成慢性哮喘動(dòng)物模型。miR-21抑制表達(dá)組、miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組、miR-21抑制表達(dá)+中藥組在造模前給予miR-21慢病毒溶液（病毒數(shù)量1.0×108/mL）滴鼻，每次0.1 mL。每3日滴1次，共4次。滴鼻前后分別檢測(cè)血清中miR-21表達(dá)情況，表達(dá)差異達(dá)5倍以上認(rèn)為造模成功，開(kāi)始慢性哮喘造模。慢性持續(xù)期大鼠造模參照文獻(xiàn)［6-7］進(jìn)行改進(jìn)：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，應(yīng)用卵蛋白吸入法建立哮喘大鼠模型，于實(shí)驗(yàn)第0、12天，每只大鼠腹腔注射10% OVA溶液（含Ⅱ級(jí)1 mg OVA和100 mg氫氧化鋁凝膠的無(wú)菌抗原液致敏）1 mL致敏，此后每天用5% OVA激發(fā)30 min，持續(xù)5 d，然后隔日激發(fā)1次，共激發(fā)6周，造成慢性大鼠哮喘模型。

1.4 干預(yù)方法 正常組不做任何處理，模型組、miR-21抑制表達(dá)組、miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組給予同等體積生理鹽水灌胃；miR-21抑制表達(dá)+中藥組、中藥組在第2次致敏后第4天開(kāi)始給予中藥藥液灌胃，將中藥溶解為含藥量1 080 g/L溶液，按5 mL/kg灌胃。各組均于末次激發(fā)24 h后處死。

1.5 觀察指標(biāo) 1）大鼠一般情況。觀察大鼠精神、體質(zhì)量、呼吸、飲食等一般情況。2）大鼠BALF及外周血中EOS計(jì)數(shù)。主動(dòng)脈穿刺采血后結(jié)扎，結(jié)扎右肺主支氣管。用含1%肝素的無(wú)菌生理鹽水經(jīng)氣管插管后進(jìn)行左肺支氣管肺泡灌洗，并且重復(fù)6次，同時(shí)回收BALF。采用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)BALF和外周血中EOS的數(shù)量。3）大鼠氣道形態(tài)學(xué)檢測(cè)。在400倍光鏡下選擇3支具有完整橫斷面的中小支氣管，利用計(jì)算機(jī)圖像分析儀分別測(cè)支氣管壁內(nèi)周長(zhǎng)（Pi）、基底膜面積（WAi）、氣道平滑肌層面積（WAm），并使WAi、WAm與Pi的比值作為標(biāo)化測(cè)量分別代表支氣管基底膜厚度（WAi/Pi）和平滑肌層厚度（WAm/Pi）。4）大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA檢測(cè)。取小鼠肺組織樣本，剪碎后Trizol提取總RNA，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以β-actin為內(nèi)參。引物序列如下；miR-21上游 5'-CCTGCCTGAGCACCTGCTGC-3'，下游 5'-GA CTGTGACGACTACCCCAA-3'；eotaxin上游 5'-TCAC?GCTGCAACCCATCTGC-3'，下游 5'-CCAAGGCCAAC CGCGAGAAGATGAC-3'；β-actin上游5'-ACTATCG?GCAATGAGCGGTTCC-3'，下游5'-GAGCCACCAATC?CACACAGAGT-3'。參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR的循環(huán)條件：95℃ 30 s預(yù)變性，（95℃ 10 s，60℃40 s）×30個(gè)循環(huán)，得數(shù)據(jù)以2-ΔΔct計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般生理狀態(tài) 正常組：大鼠毛發(fā)光亮，神態(tài)安靜，動(dòng)作靈敏，呼吸平穩(wěn)，飲食正常，大小便正常。模型組：大鼠精神狀態(tài)較差，隨著激發(fā)次數(shù)增多，呼吸加快、點(diǎn)頭樣喘息明顯，蜷伏不安，皮毛暗黃干澀無(wú)光澤、時(shí)有脫落，食量下降、體質(zhì)量增加緩慢的癥狀。miR-21抑制表達(dá)組：大鼠安靜少動(dòng)，毛發(fā)稍松散，偶有咳嗽、喘息癥狀，食欲良好，個(gè)別大鼠出現(xiàn)互相撕咬。miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組：大鼠活動(dòng)明顯減少或難以行動(dòng)，反應(yīng)遲鈍，精神狀態(tài)較差，毛發(fā)倒立、無(wú)光澤，隨著激發(fā)次數(shù)增多，大鼠出現(xiàn)鼠毛蓬松，食量、體質(zhì)量下降等癥狀。miR-21抑制表達(dá)+中藥組：哮喘激發(fā)開(kāi)始后，大鼠偶可出現(xiàn)搔鼻、咳嗽、喘息等癥狀。經(jīng)平喘顆粒治療后，大鼠上述癥狀緩解，毛發(fā)松散、有光澤，食量較好，體質(zhì)量增加。中藥組：經(jīng)平喘顆粒治療后，癥狀較模型組有所緩解，呼吸逐漸平穩(wěn)，皮毛有光澤，活動(dòng)度、食量、體質(zhì)量逐漸恢復(fù)。

2.2 各組大鼠BALF及外周血中細(xì)胞EOS計(jì)數(shù) 見(jiàn)表1。與正常組比較，模型組BALF及外周血中EOS的數(shù)量明顯升高（P＜0.01），中藥組治療可顯著降低BALF及外周血中EOS的數(shù)量（P＜0.01）；miR-21抑制表達(dá)組數(shù)量低于模型組（P＜0.01），與miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組比較，miR-21抑制表達(dá)組BALF及外周血中EOS的數(shù)量明顯降低（P＜0.01），miR-21抑制表達(dá)+中藥組治療可顯著降低BALF及外周血中EOS的數(shù)量（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各組大鼠BALF及外周血中細(xì)胞EOS計(jì)數(shù)比較（×105/L，±s）

表1 各組大鼠BALF及外周血中細(xì)胞EOS計(jì)數(shù)比較（×105/L，±s）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01；與miR-21抑制表達(dá)組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組比較，◇◇P＜0.01。下同。

外周血中EOS計(jì)數(shù)7.03±3.07 32.66±5.12##31.71±2.58**◇◇32.11±5.60##21.67±4.54△◇◇24.71±3.93##**組別正常組模型組miR-21抑制表達(dá)組miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組miR-21抑制表達(dá)+中藥組中藥組n 20 20 20 20 20 20 BALF中EOS計(jì)數(shù)5.79±3.13 33.10±5.61##24.88±5.81**◇◇31.62±4.14##20.90±5.64△△◇◇26.96±5.34##**

2.3 各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)變化比較 見(jiàn)表2，圖1。與正常組比較，模型組WAi/Pi、WAm/Pi比值明顯升高（P＜0.01），中藥組可顯著降低WAi/Pi、WAm/Pi比值（P＜0.01）；miR-21抑制表達(dá)組比值低于模型組（P＜0.01），與miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組比較，miR-21抑制表達(dá)組WAi/Pi、WAm/Pi比值明顯降低（P＜0.01），miR-21抑制表達(dá)+中藥組治療均可顯著降低WAi/Pi、WAm/Pi比值（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)變化比較（μm2/μm，±s）

表2 各組大鼠氣道形態(tài)學(xué)變化比較（μm2/μm，±s）

組別正常組模型組miR-21抑制表達(dá)組miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組miR-21抑制表達(dá)+中藥組中藥組n 20 20 20 20 20 20 WAi/Pi 24.10±5.38 51.17±4.69##39.43±5.39**◇◇50.11±5.32##33.88±7.07△△◇◇42.75±5.60##**WAm/Pi 17.55±5.19 50.65±6.26##39.73±5.62**◇◇51.68±5.50##35.88±4.48△◇◇40.21±4.57##**

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，400倍）

2.4 各組大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA表達(dá)量比較 見(jiàn)表3。與正常組比較，模型組miR-21、Eotax?in mRNA表達(dá)量比值明顯升高（P＜0.01），中藥組治療可顯著降低miR-21、Eotaxin mRNA表達(dá)量（P＜0.01）；miR-21抑制表達(dá)組表達(dá)量低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），與miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組比較，miR-21抑制表達(dá)組miR-21、Eotaxin mRNA表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與miR-21抑制表達(dá)組比較，miR-21抑制表達(dá)+中藥組治療均可顯著降低miR-21、Eotaxin mRNA含量（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA表達(dá)量比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織miR-21、Eotaxin mRNA表達(dá)量比較（±s）

組別正常組模型組miR-21抑制表達(dá)組miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組miR-21抑制表達(dá)+中藥組中藥組n 20 20 20 20 20 20 miR-21/β-actin 1.06±0.20 4.80±0.25##3.22±0.15**◇◇4.87±0.17##1.92±0.15△△◇◇3.50±0.21##**Eotaxin/β-actin 0.39±0.026 1.11±0.072##0.75±0.098*◇◇1.09±0.25##0.54±0.033△◇◇0.64±0.57##**

3 討 論

《臨證指南醫(yī)案·哮》云“邪散則喘亦止，后不復(fù)發(fā)……若因根本有虧，腎虛氣逆，濁陰上逆而喘者，此不過(guò)一二日之間，勢(shì)必危篤……若夫哮證……邪伏于里，留于肺俞，故頻發(fā)頻止，淹纏歲月”。宿痰伏肺是哮喘發(fā)病的基礎(chǔ)，腎陽(yáng)虧虛貫穿發(fā)病始終［8］，哮喘病機(jī)多虛實(shí)夾雜，二者相互影響，疊加復(fù)重，導(dǎo)致哮喘遷延難愈，發(fā)病關(guān)鍵在于“陽(yáng)虛痰盛”。治療用溫陽(yáng)益氣、平喘化痰法，依據(jù)該法組成溫陽(yáng)益氣化痰平喘方，并對(duì)該方化裁，制備成平喘顆粒，由淫羊藿、炙麻黃、太子參、黃芪、五味子、款冬花、地龍、罌粟殼、知母組成。方中淫羊藿、炙麻黃為君藥，有溫陽(yáng)平喘之功；太子參補(bǔ)氣生津，黃芪益氣升陽(yáng)，五味子、款冬花斂肺潤(rùn)肺，地龍配麻黃加強(qiáng)平喘之效，以上5味共為臣藥；罌粟殼為佐藥，起斂肺止咳之效；知母為使藥可以引藥歸經(jīng)，潤(rùn)肺止咳，有補(bǔ)虛之用。方中藥物合用升降有序，收散并施，使腎陽(yáng)得補(bǔ)，肺陽(yáng)得溫，痰濕得化，咳喘得消。

近年來(lái)研究Micro RNA與哮喘相關(guān)性較多，其中miR-21備受關(guān)注。有研究指出［9］，哮喘的炎癥miR-21表達(dá)與哮喘的癥狀和炎癥反應(yīng)程度呈正相關(guān)，可能是控制哮喘重要指標(biāo)。同時(shí)應(yīng)用miR-21拮抗劑可選擇性下調(diào)miR-21的表達(dá)，降低BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，以及IL-4在內(nèi)的Th2細(xì)胞因子水平，降低氣道EOS浸潤(rùn)［10-11］。哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，其病理改變?yōu)檠仔约?xì)胞浸潤(rùn)［12］。EOS作為哮喘炎癥的最主要標(biāo)志之一，在哮喘的發(fā)病中起重要作用。成熟的EOS由骨髓CD34+祖細(xì)胞增殖活化而成［13］，可分泌多種炎癥介質(zhì)，致使平滑肌痙攣和微血管通透性增加［14］，同時(shí)大量炎癥因子可調(diào)節(jié)其生成［15］，介導(dǎo)和促進(jìn)氣道炎癥產(chǎn)生。Eotaxin為CC亞族趨化因子，為EOS的催化劑，對(duì)炎癥細(xì)胞的活化、聚集起重要作用，使EOS從血液募集到氣道上皮，通過(guò)釋放各種炎癥介質(zhì)致使氣道上皮損傷［16］。從查閱相關(guān)文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，其三者可能具有相關(guān)性，由此猜測(cè)miR-21能夠調(diào)控Eotaxin，從而影響EOS水平，并用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究結(jié)果顯示，模型組與空白組比較，miR-21、Eotaxin mRNA、BALF及外周血中細(xì)胞EOS明顯升高，而miR-21抑制表達(dá)組以上指標(biāo)明顯降低，提示抑制miRNA的表達(dá)可以影響Eotaxin mRNA及BALF及外周血中細(xì)胞EOS水平。miR-21抑制表達(dá)+中藥組與miR-21抑制表達(dá)載體對(duì)照組比較，miR-21、Eotaxin mRNA、BALF及外周血中細(xì)胞EOS明顯降低；中藥組與模型組比較，以上指標(biāo)明顯降低，提示平喘顆?？梢酝ㄟ^(guò)抑制miR-21的表達(dá)，降低大鼠肺組織Eotaxin mRNA及BALF及外周血中細(xì)胞EOS水平，改善氣道形態(tài)學(xué)變化，從而減輕氣道炎癥。

綜上所述，平喘顆粒能夠通過(guò)抑制miR-21的表達(dá)，降低Eotaxin mRNA表達(dá)，從而影響EOS水平，減輕氣道炎癥，起到治療哮喘的作用。