張曉彬，倪茂君，王靜霞，彭朝榮，陳竹平

(四川省原子能研究院 輻照保藏四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610101)

目前中藥提取方法多采用傳統(tǒng)溶劑提取法，有效成分損失較多，尤其是水不溶性成分；提取過(guò)程中有機(jī)溶劑可能與有效成分作用，使其失去原有活性；非有效成分不能被最大限度地除去，濃縮度不夠；提取液中除有效成分外，雜質(zhì)較多；高溫操作引起熱敏性有效成分的大量分解等[1]。特別是隨著中藥材使用量的增大，中藥材品質(zhì)參差不齊，同樣造成提取效率低，品質(zhì)差。發(fā)展中草藥先進(jìn)提取技術(shù)是中草藥提取的重點(diǎn)發(fā)展方向。

輻照技術(shù)是以高能射線照射為物質(zhì)提供高能量離子，使物質(zhì)產(chǎn)生降解或化學(xué)反應(yīng)，具有常溫操作、環(huán)保無(wú)污染、穿透性好等優(yōu)點(diǎn)，與中藥材炮制有異曲同工之處。目前已證明其安全性，并廣泛用于中藥材輻照滅菌，而研究表明，輻照可提高綠茶中茶多酚含量，提高抗氧化活性，減小氣味和顏色[2]；龍金花等[3]研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)水提取法、溶劑提取法相比，輻照預(yù)處理輔助提取五倍子單寧酸的得率分別提高了15.13%和20.13%。與中藥材輻照滅菌應(yīng)用相比，高能射線輻照在中藥材其他方面的應(yīng)用研究相對(duì)較少[4-9]。根據(jù)輻照技術(shù)特點(diǎn)及中藥材有效成分多樣性和化學(xué)組成特殊性，將輻照技術(shù)作為新能源和新方法應(yīng)用于中藥材有效成分提取、品質(zhì)提升等領(lǐng)域可提高經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)中藥材、中藥企業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。

根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)部的《60Co輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》[衛(wèi)藥發(fā)1997第38號(hào)]，國(guó)家科委“七五”公關(guān)項(xiàng)目“60Co-γ射線輻照中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究”、國(guó)家科委“八五”公關(guān)項(xiàng)目“60Co輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用研究”，中藥輻照滅菌多使用的最大吸收劑量為6 kGy,對(duì)于紫苑、錦燈籠、乳香、天竺黃、補(bǔ)骨脂輻照滅菌時(shí)最大吸收劑量不超過(guò)3 kGy，含有龍膽苦苷的秦?fù)毢妄埬懖坏幂椪諟缇?。本文選取人參、黃連、黃芪、川芎、天麻、丹參6種中藥材，在中藥材常規(guī)提取的基礎(chǔ)上，研究輻照輔助處理對(duì)中藥材有效成分提取率的影響，篩選可用于輻照輔助提取的中藥品種及有效成分，為進(jìn)一步分離、純化提供數(shù)據(jù)支撐，為輻照加工技術(shù)在中藥材提取領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 主要儀器與裝置

高效液相色譜儀(HPLC)：UltiMate3000，美國(guó)Dionex公司；紫外分光光度計(jì)：Evolution 220，美國(guó)Thermo Scientific公司；數(shù)控超聲波清洗器：KH2200DE型，功率100 W，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 主要材料與試劑

人參、黃連、黃芪、川芎、天麻、丹參：均為大宗藥材，其中川芎、天麻、黃連、丹參均為四川產(chǎn)道地藥材，購(gòu)自太極大藥房，藥材打粉后過(guò)40目篩備用；中草藥提取物對(duì)照品：提取物標(biāo)準(zhǔn)品，成都曼斯特生物科技有限公司；乙醇、甲醇：分析純，成都市科龍化工試劑廠；超純水：18.25 MΩ·cm，實(shí)驗(yàn)室自制。

2 實(shí)驗(yàn)方法

將中藥材粉末材料分裝為每份10 g，送至四川省原子能研究院輻照工程中心，分別使用60Co-γ射線輻射裝置和GJ-2工業(yè)電子加速器(2 MeV，20 kW)進(jìn)行輻照處理，吸收劑量為5、15、30 kGy。處理后對(duì)不同藥材有效成分進(jìn)行提取與檢測(cè)。

2.1 川芎

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的芎粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，置50 mL細(xì)口絲口瓶中，加入70%甲醇50 mL，50 ℃加熱超聲提取30 min，冷卻后再稱(chēng)定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻靜置，取上清液，用0.22 μm濾膜過(guò)濾，取濾液送液相色譜檢測(cè)。對(duì)照品為阿魏酸，檢測(cè)柱為C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，以甲醇-1%醋酸溶液(30∶70)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)321 nm，進(jìn)樣量10 μL。按公式(1)計(jì)算相對(duì)提取率：

相對(duì)提取率=Yi/Y0×100%

(1)

其中，Yi為不同處理?xiàng)l件提取量，Y0為未處理樣品提取量。

2.2 天麻

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的天麻粉末2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL細(xì)口絲口瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，攪拌并稱(chēng)定重量，50 ℃超聲提取2 h，冷卻，再稱(chēng)定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量。天麻提取液用0.22 μm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾，取續(xù)濾液約12 mL送液相檢測(cè)。對(duì)照品為天麻素，檢測(cè)柱為C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，以乙腈-0.05%磷酸溶液(3∶97)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量10 μL。按公式(1)計(jì)算相對(duì)提取率。

2.3 丹參

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后丹參粉末，精密稱(chēng)量0.3 g，置50 mL細(xì)口絲口瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定重量，超聲提取30 min，冷卻后再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，補(bǔ)足后的提取液送液相色譜檢測(cè)。色譜柱選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相為乙腈(A)和0.02%磷酸水溶液(B)；洗脫梯度如下：0～20 min(80%B)，20～50 min(20%B)，50～55 min(80%B)，柱溫25 ℃，流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。按公式(1)計(jì)算相對(duì)提取率。

2.4 人參

取未輻照、60Co-γ射線輻照后的人參粉末，精密稱(chēng)取1 g上述人參粉末樣品，加入70%乙醇15倍量，超聲提取3次，每次1 h，合并提取液，濾過(guò)，濾液用70%乙醇定容至50 mL，過(guò)0.22 μm濾膜，作為樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。色譜柱為 C18柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，柱溫25 ℃；二元線性梯度洗脫，流動(dòng)相為乙腈(A)和蒸餾水(B)；洗脫梯度如下：0～18 min(85%B)，18～28 min(77%B)，28～47 min(70%B)，47～52(56%B)，52～69 min(32%B)，69～84 min(0%B)，84～89 min(85%B)；柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。

以紫外分光光度法檢測(cè)人參總皂苷含量，按公式(1)計(jì)算相對(duì)提取率。

2.5 黃連

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的天麻粉末0.2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL細(xì)口絲口瓶中，加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合溶液20 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲提取30 min，冷卻后稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。色譜柱選用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(30∶70)，檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm；流速0.7 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。按公式(1)計(jì)算相對(duì)提取率。

2.6 黃芪

取未輻照、60Co-γ射線及電子束輻照后的黃芪粉5 g，加入8倍量pH為9的氧化鈣堿性水溶液和5%的乙醇，稱(chēng)重后于50 ℃超聲提取30 min，過(guò)濾收集濾液，重復(fù)提取，合并2次濾液，提取液經(jīng)濃縮后，90%乙醇沉淀，離心收集多糖，上清液經(jīng)濃縮后二次沉淀，合并多糖，干燥得黃芪粗多糖。

按以下公式計(jì)算粗多糖得率：

粗多糖得率=粗多糖含量/黃芪粉含量×100%

(2)

取0.1 g粗多糖，定容至10 mL，配置成1%濃度的黃芪多糖溶液，按苯酚硫酸法測(cè)定提取液中黃芪多糖含量，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm。

2 結(jié)果與討論

考察不同輻照源及吸收劑量對(duì)中草藥有效成分的影響，選取60Co及電子加速器兩種輻照源，參照《60Co輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)》，中藥輻照滅菌多使用的最大吸收劑量為6 kGy，選擇5 kGy輻照組作為對(duì)照，15 kGy、30 kGy、40 kGy輻照組為吸收提取實(shí)驗(yàn)劑量。

2.1 輻照對(duì)川芎有效成分的影響

阿魏酸是川芎中有機(jī)酸類(lèi)主要有效成分，約占生藥含量的0.1%～0.2%，阿魏酸及其衍生物可抑制血小板聚集，抗血栓形成，抗炎止痛等，輻照對(duì)阿魏酸的影響示于圖1。從圖1中可以看出，輻照源對(duì)阿魏酸含量的影響有較大差異。隨著吸收劑量的增加，不同輻照源下阿魏酸含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。60Co-γ射線輻照下阿魏酸含量和提取率明顯高于電子加速器輻照，采用60Co-γ輻照，阿魏酸分解率較低，15 kGy情況下僅減少4.18%；電子加速器輻照下，阿魏酸在5 kGy輻照時(shí)即快速分解，30 kGy時(shí)提取率為未輻照時(shí)的92.60%，含量減少7.7%。

A—未輻照；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

取液高效液相色譜圖及阿魏酸結(jié)構(gòu)示于圖2。從圖2中可以看出，輻照處理后，色譜圖中主要出峰時(shí)間及峰面積無(wú)明顯差異，表明阿魏酸結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。其提取含量降低可能是由于分子結(jié)構(gòu)中含有活性羥基、羧基及雙鍵等官能團(tuán)，在不同能量作用下部分分子結(jié)構(gòu)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)造成的，瞬時(shí)能量越高，反應(yīng)越大，因此不同輻照源輻照輔助處理后提取率差異較大。

2.2 輻照對(duì)天麻有效成分的影響

中藥天麻的主要有效成分為天麻素，具有較好的鎮(zhèn)靜和安眠作用，對(duì)神經(jīng)衰弱、失眠、頭痛癥狀有緩解作用。輻照輔助處理對(duì)天麻有效成分提取的影響列于表1。從表1中可以看出，60Co-γ射線輻照與電子加速器輻照結(jié)果一致，均隨著吸收劑量的增加逐漸減少，二者無(wú)顯著差異。這一結(jié)果可能與天麻素分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表1 輻照對(duì)天麻有效成分的影響

天麻提取液高效液相色譜圖及天麻素結(jié)構(gòu)示于圖3。從圖3中可以看出，不同輻照處理后，天麻提取液液相色譜圖無(wú)明顯差異，表明輻照對(duì)天麻提取液中物質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。天麻素分子中含有大量羥基及醚鍵，但分子結(jié)構(gòu)中含有較穩(wěn)定的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因此，隨著輻射劑量增大，可能導(dǎo)致其分子中醚鍵發(fā)生斷裂，從而使天麻素檢測(cè)含量降低。

A—未輻照；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.3 輻照對(duì)丹參有效成分的影響

丹參主要活性成分包括脂溶性成分(丹參酮類(lèi)、丹參內(nèi)酯等)和水溶性成分(丹參素、丹酚酸等)，甲醇提取獲得的有效成分以酮類(lèi)為主，總丹參酮有抗菌、消炎、活血化瘀、促進(jìn)傷口愈合等多方面作用。輻照對(duì)丹參脂溶性成分的影響列于表2。從表2中可以看出，在30 kGy以?xún)?nèi)輻照處理后，丹參脂溶性成分均出現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)。不同輻照源中，60Co-γ輻照對(duì)丹參脂溶性成分影響較大：電子加速器輻照30 kGy隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA分別減少3.32%、4.57%和4.05%，而60Co-γ輻照30 kGy后分別減少8.86%、5.14%和3.85%。丹參酮ⅡA相對(duì)其他脂溶性成分變化率較小，這可能與其相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

表2 輻照對(duì)丹參脂溶性有效成分的影響

丹參提取液高效液相色譜圖及丹參酮類(lèi)結(jié)構(gòu)示于圖4。從圖4中可以看出，輻照輔助處理后丹參提取液色譜圖無(wú)明顯變化，表明其主要成分結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。從脂溶性丹參酮結(jié)構(gòu)中可以看出，丹參酮為菲醌類(lèi)化合物，分子骨架中發(fā)生共軛形成大π鍵，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮分子共軛體系依次縮小，從而導(dǎo)致其輻射效應(yīng)的不同。

A—未輻照；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.4 輻照對(duì)人參有效成分的影響

不同人參皂苷液相檢測(cè)結(jié)果示于圖5。從圖5中可以看出，輻照對(duì)不同人參皂苷的影響具有顯著差異。其中，隨吸收劑量增加，人參三醇皂苷Re含量分別降低0.9%、9.74%和25.34%；而Rg2變化率則為-8.15%，18.77%和4.48%，當(dāng)吸收劑量為15 kGy時(shí)具有較大值。人參二醇皂苷中，人參皂苷Rb1的含量隨著吸收劑量的增加，呈逐漸上升趨勢(shì)，15 kGy有最大值4.17 mg/g；Rg3含量先減小后增大，15 kGy有最大值；而Rd則分別降低0%，5.75%和16.52%。造成這一結(jié)果的原因可能是人參皂苷種類(lèi)繁多，因此在輻照過(guò)程，皂苷的降解造成總皂苷含量降低，但也有可能形成部分皂苷間的相互轉(zhuǎn)化，從而提高某種皂苷含量。

圖5 輻照對(duì)人參皂苷成分含量的影響

輻照對(duì)人參總皂苷提取得率的影響列于表3。從表3中可以看出，隨著吸收劑量增大，人參總皂苷含量逐漸降低，輻照易造成人參皂苷結(jié)構(gòu)的改變和降解。人參皂苷都具有相似的基本結(jié)構(gòu)，都含有由30個(gè)碳原子排列成四個(gè)環(huán)的甾烷類(lèi)固醇核。依糖苷基架構(gòu)的不同而被分為兩組：達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型。達(dá)瑪烷類(lèi)型包括兩類(lèi)：人參二醇型-A型，苷原為20(S)-原人參二醇。包含了最多的人參皂苷，如人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2及糖苷基PD；人參三醇型-B型，苷原為20(S)-原人參三醇。包含了人參皂苷Re、Rg1、Rg2、Rh1及糖苷基PT。

表3 輻照對(duì)人參總皂苷的影響

2.5 輻照對(duì)提取黃連有效成分的影響

黃連中主要有效成分為生物堿類(lèi)，輻照對(duì)黃連中鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿提取得率的影響列于表4。從表4中可以看出，輻照源對(duì)黃連中有效成分的影響具有明顯差異。60Co-γ射線輻照后，鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿含量均隨著輻照劑量增加而先降低后增加，在15 kGy劑量下有最小值。而電子加速輻照后，5 kGy劑量下有效成分提取得率較低，隨著劑量增大，有效成分含量逐漸增大。

表4 輻照對(duì)黃連有效成分的影響

輻照對(duì)黃連有效成分提取率的影響示于圖6。由圖6可知，5 kGy電子束輻照后鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿含量分別降低10.68%和7.87%，但增大吸收劑量至40 kGy后，黃連中鹽酸小檗堿含量提高2.29%，而鹽酸巴馬汀含量與未輻照相比降低1.68%。這一結(jié)果可能是由于黃連中具有較多纖維素及木質(zhì)素，木質(zhì)素以輻照交聯(lián)為主[10]，纖維素易于輻照裂解。低劑量輻照下，主要有效成分在提取過(guò)程中不易溶出，木質(zhì)素快速交聯(lián)導(dǎo)致溶出降低；隨著劑量增大，纖維素降解增大，有效成分溶出增大，提取率則相對(duì)增大。

圖6 輻照對(duì)黃連有效成分提取率的影響

黃連提取液高效液相色譜圖示于圖7，本研究考察了鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀這兩種生物堿成分。從結(jié)構(gòu)上可以看出，小檗堿及巴馬汀為異喹啉生物堿，骨架結(jié)構(gòu)能夠耐受高輻射劑量。兩種生物堿的輻解反應(yīng)雖然較難發(fā)生，但受到低劑量下木質(zhì)素輻照交聯(lián)相對(duì)分子質(zhì)量快速提高的限制，溶出能力受阻，因此高劑量輻照有利于黃連有效成分的溶出和提取率的提高。

A—未輻照(A)；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy(D)；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.6 輻照對(duì)黃芪有效成分的影響

黃芪多糖是黃芪主要有效成分之一，具有提高免疫力、抗氧化、抗癌、抗衰老等多重功效，應(yīng)用較廣。黃芪經(jīng)不同輻射源及輻射劑量處理后，其提取液黃芪多糖含量與粗多糖提取得率示于圖8。從圖8中可以看出，不同輻照源下，黃芪粗多糖得率均隨著吸收劑量增大逐漸增大，電子加速器輻照(E/F/G)提取得率均大于60Co-γ輻照(B/C/D)；粗多糖中黃芪多糖含量均隨著吸收劑量增加先增大后減小，電子加速器輻照15 kGy具有極大值，明顯優(yōu)于60Co-γ輻照(B/C/D)。從圖中還可看出，劑量越高，粗多糖得率越高，但多糖含量越低，純度較低。造成這一結(jié)果的原因可能是，一方面黃芪多糖、纖維素等大分子均在高能量作用下產(chǎn)生降解，從而使提取過(guò)程中纖維素易于溶脹，黃芪多糖分子易于溶出，提取得率增大，但黃芪多糖分子量分布寬，隨著劑量增大，降解過(guò)程中小分子進(jìn)一步降解成單糖或寡糖去除，失去生物活性，因此含量隨著吸收劑量增大而先增大后減??；另一方面，纖維素降解有利于多糖溶出，同時(shí)也有利于其他雜質(zhì)分子的溶出，造成雜質(zhì)含量增大，多糖純度降低，給后續(xù)純化造成難度。因此適宜的輻照工藝為電子加速器輻照15 kGy，該條件下黃芪多糖提取率和純度均較高。

A—未輻照(A)；B—60Co-γ輻照5 kGy；C—15 kGy；D—30 kGy(D)；E—電子加速器輻照5 kGy；F—15 kGy；G—30 kGy

2.7 輻照前后中藥材有效成分的變化

表5匯總了輻照對(duì)6種中藥材各種有效成分的影響，從表5中可以看到黃連的有效成分鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿，丹參中的脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA在輻照中藥滅菌劑量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的劑量下，有效成分含量改變不大；天麻、川芎等有效成分在輻照過(guò)程中易產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，有效成分含量降低，通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明這兩種中藥不適用于輻照輔助提?。稽S芪經(jīng)輻照處理后，提取過(guò)程中纖維素溶脹增大，在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的劑量范圍內(nèi)，5 kGy輻照組相對(duì)于未輻照組提取率提高17.59%，黃芪可以采用輻照輔助提取，提高黃芪多糖提取率。

表5 輻照對(duì)中藥材有效成分的影響

3 結(jié)論

(1)黃芪經(jīng)輻照處理后，其纖維素和多糖分子降解，提取過(guò)程中纖維素溶脹增大，多糖提取率提高，電子加速器優(yōu)于γ射線，最佳條件為電子束輻照15 kGy。該方法輻照工藝簡(jiǎn)便，提取率高，有利于促進(jìn)黃芪多糖提取工藝的進(jìn)步，具有較大的應(yīng)用前景。

(2)中藥材有效成分結(jié)構(gòu)對(duì)其輻照穩(wěn)定性具有較大的影響。黃連、丹參等有效成分具有較穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，低劑量下有效成分含量改變不大，高劑量下，纖維素降解，有利于有效成分的溶出，從而提高提取得率；而天麻、川芎等有效成分分子結(jié)構(gòu)中含有較多活性官能團(tuán)，在輻照過(guò)程中易產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，造成結(jié)構(gòu)改變或降解，有效成分含量降低。根據(jù)中藥材有效成分結(jié)構(gòu)與反應(yīng)活性，對(duì)中藥材輻照滅菌過(guò)程中的有效成分及藥理藥效研究具有重要的參考價(jià)值。

(3)輻照會(huì)造成人參皂苷化學(xué)鍵斷裂，從而造成人參皂苷含量降低；但在一定劑量下，可能促進(jìn)不同人參皂苷間的轉(zhuǎn)化，從而使某類(lèi)皂苷含量提高，對(duì)人參皂苷的研究具有重要意義。

(4)中藥材輻照不僅能夠起到滅菌的作用，通過(guò)輻照輔助提取考察中藥材有效成分的變化，篩選可用于輻照提取的中藥材及有效成分，為輻照加工技術(shù)在中藥材提取領(lǐng)域的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。