陳秀波，段文標(biāo)，陳立新，朱德全，趙晨晨，劉東旭

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.貴州財(cái)經(jīng)大學(xué)藝術(shù)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.佳木斯大學(xué)理學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；4.佳木斯大學(xué)中-烏農(nóng)林技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 佳木斯 154007)

紅松(Pinuskoraiensis)是我國(guó)東北地區(qū)的珍貴針葉樹種，以紅松為主的混交林是本地區(qū)地帶性頂極群落，具有極高的生產(chǎn)力和生態(tài)地位。同時(shí)該區(qū)域存在島狀永久性凍土，屬于全球氣候變化敏感區(qū)域[1]。19世紀(jì)初開始，大量原始紅松被砍伐，除少數(shù)保護(hù)區(qū)外原始紅松林已基本消失[2]，保護(hù)和維持紅松林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定成為學(xué)界關(guān)注的重點(diǎn)。

紅松作為溫帶地區(qū)頂極群落紅松混交林的建群種，在紅松幼苗更新、次生演替、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)達(dá)到頂級(jí)群落的過(guò)程中，反硝化微生物在土壤氮素循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。研究不同原始紅松林土壤反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，有助于了解原始紅松林土壤的氮循環(huán)過(guò)程。然而，目前采用功能基因研究原始紅松林土壤中的反硝化微生物群落特征及其與土壤理化性質(zhì)之間相互關(guān)系鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以位于黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)涼水國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)的3種典型原始紅松混交林(云冷杉紅松林、椴樹紅松林和楓樺紅松林)的林下土壤為對(duì)象，以反硝化功能基因nirK為分子靶標(biāo)，采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)比分析3種林型下土壤的nirK型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征，通過(guò)冗余分析探索影響原始紅松林土壤nirK型反硝化菌群的關(guān)鍵土壤理化因子，從而為深入了解不同原始紅松林土壤的反硝化潛勢(shì)和氮循環(huán)過(guò)程提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究樣地位于黑龍江省伊春市帶嶺區(qū)境內(nèi)的小興安嶺涼水國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)(128°53′20″E，47°10′50″N)，樣地基本信息見(jiàn)表1。

表1 小興安嶺3種原始紅松林樣地基本信息Table 1 Basic information of sampling sites of three types of primitive Pinus koraiensis forest of Lesser Khingan Mountains

研究區(qū)域地帶性植被類型是以紅松為主的混交林，土壤為山地暗棕色森林土。該區(qū)域具有明顯的溫帶大陸性季風(fēng)氣候特征，春季來(lái)臨遲緩，降水較少；夏季短促，降雨集中在6—8月，占全年降水量的60%以上。氣溫較高，秋季降溫快；冬季漫長(zhǎng)，多風(fēng)雪，嚴(yán)寒干燥。年平均氣溫只有-3 ℃，年平均地溫1.2 ℃，年平均降水量667 mm，年平均相對(duì)濕度78%。在該區(qū)域內(nèi)，選取3種典型原始紅松林[云冷杉紅松林(編號(hào)A)、椴樹紅松林(編號(hào)B)和楓樺紅松林(編號(hào)C)]，坡位為陽(yáng)坡，坡向均為西南方向。每種林型設(shè)置4塊面積為25 m×25 m的樣地。對(duì)所有樣地的優(yōu)勢(shì)喬灌木進(jìn)行每木檢尺和植物調(diào)查，3種原始林中的藤本植物主要為狗棗獼猴桃(Actinidiakolomikta)和忍冬(Lonicerajaponica)。草本植物主要以鱗毛蕨(Dryopterisspp.)、東北蹄蓋蕨(Athyriumbrevifrons)和蚊子草(Filipendulapalmata)為主。

1.2 土壤樣品采集和理化因子的測(cè)定

根據(jù)森林土壤分析方法測(cè)定土壤理化性質(zhì)[17]。使用Delta 320 pH計(jì)(梅特勒-托利多公司)測(cè)定土壤pH；采用環(huán)刀法測(cè)定土壤容重和土壤孔隙度；采用烘干法測(cè)定土壤含水量，凱氏定氮法測(cè)定全氮含量[17]；采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定有機(jī)碳含量[18]；采用鉬銻抗比色法測(cè)定全磷含量[19]；采用酚二磺酸比色法測(cè)定硝態(tài)氮含量[20]；采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定銨態(tài)氮含量[17]。

1.3 土壤微生物DNA提取、nirK基因擴(kuò)增和測(cè)序

稱取0.5 g土樣，采用Fast?DNA SPIN Kit (MP Biomedicals,CA,USA)提取土壤微生物的總DNA，然后采用PowerClean?DNA Clean-up Kit (MoBio,CA,USA)對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化，測(cè)定其濃度及純度后，置于冰箱中-20 ℃保存。采用引物nirK-F(TCATGGTGCTGCCGCGYGANGG)和nirK-R(GAACTTGCCGGTKGCCCAGAC)擴(kuò)增nirK基因的高變區(qū)片段[21]。PCR反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。PCR反應(yīng)后用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，并用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。利用Quant-iTPico Green dsDNA Assay Kit (Invitrogen,USA)對(duì)PCR產(chǎn)物在Microplate reader (FLx800,BioTek)上進(jìn)行定量，然后按照每個(gè)樣品所需的數(shù)據(jù)量進(jìn)行混樣，構(gòu)建Miseq文庫(kù)。采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit(Illumina,USA)制備測(cè)序文庫(kù)。依據(jù)PCR產(chǎn)物濃度，將所有擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物等量混合，采用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行雙末端250 bp測(cè)序。數(shù)據(jù)下機(jī)后，去除reads接頭和barcode序列，同時(shí)采用FLASH軟件對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，去除低質(zhì)量序列，并采用Usearch軟件(Vsesion 7.0，http://drive5.com/uparse/)去除嵌合體序列，并對(duì)處理得到的高質(zhì)量序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

采用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST序列比對(duì)工具[22]，對(duì)獲得的高質(zhì)量序列，按97%的序列相似度進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)劃分和歸并，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。隨后，根據(jù)每個(gè)OTU在每個(gè)土壤樣本中所包含的序列數(shù)，構(gòu)建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件(即OTU table)。將豐度值低于全體樣本測(cè)序總量0.001%的稀有OTU去除，去除稀有OTU和抽平后的OTU豐度矩陣用于后續(xù)分析。

采用QIIME軟件將OTU的代表序列與功能基因數(shù)據(jù)庫(kù)(FunGene)(http://fungene.cme.msu.edu/)進(jìn)行比對(duì)，獲取每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。根據(jù)OTU劃分和分類地位鑒定結(jié)果，使用QIIME軟件，獲得每個(gè)樣本在各分類水平(界、門、綱、目、科、屬、種)的具體組成。利用QIIME軟件計(jì)算每個(gè)樣本的4種α多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))。使用QIIME軟件，采用Bray-Curtis距離算法進(jìn)行樣本層級(jí)聚類樹分析，使用R軟件進(jìn)行可視化。同時(shí)通過(guò)R軟件，對(duì)3種林型的nirK型反硝化微生物群落進(jìn)行ANOSIM(analysis of similarities)分析，判斷樣本組內(nèi)和組間差異大小。用Mothur軟件，調(diào)用Metastats統(tǒng)計(jì)學(xué)算法[23]，各林型之間絕對(duì)豐度在門和屬水平上兩兩比較檢驗(yàn)，找出差異顯著的20個(gè)分類單元。應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行土壤理化性質(zhì)和α多樣性指數(shù)的差異顯著分析。采用CANNOCO 5.0軟件進(jìn)行優(yōu)勢(shì)反硝化微生物和土壤理化性質(zhì)的冗余分析。采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，分析優(yōu)勢(shì)反硝化微生物和土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性，并采用R軟件繪制相關(guān)性熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林型原始紅松混交林土壤理化性質(zhì)

經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，3種原始紅松混交林的土壤理化因子中，pH、總有機(jī)碳、土壤容重沒(méi)有顯著差異，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量在各林型之間均有顯著差異(表2)。

表2 小興安嶺3種原始紅松混交林土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of soil in three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains

2.2 不同林型原始紅松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落組成及豐度差異

采用Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)微生物nirK基因進(jìn)行測(cè)序分析，12個(gè)土壤樣品共測(cè)得原始序列848 312條，優(yōu)質(zhì)序列761 912條，長(zhǎng)度分布在173～452 bp，平均長(zhǎng)度320 bp。樣品經(jīng)過(guò)濾、拆分、去冗余后在按97%的相似度下進(jìn)行OTU分析和聚類，共得到16 939個(gè)OTUs。所有優(yōu)質(zhì)序列經(jīng)比對(duì)鑒定得到3界(細(xì)菌、古菌和無(wú)明確分類地位)6門、8綱、10目、13科、18屬、29種的土壤nirK型反硝化微生物分類學(xué)信息。3種林型土壤nirK型反硝化微生物在門和屬水平上的群落組成見(jiàn)圖1。

圖1 小興安嶺3種林型原始紅松混交林4樣地土壤的nirK型反硝化微生物門(a)和屬(b)分類Fig.1 The soil nirK type denitrifying microorganisms in four sampling plots of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains on Phylum(a)and Genus(b) level

在門分類水平上(圖1A)，3種林型土壤nirK反硝化菌群中含有大量分類地位不明確的微生物，組成比例在37.1%～59.6%。而在有注釋的微生物中，3種林型均以變形菌門(Proteobacteria)為主，其相對(duì)豐度分別為30.9%～53.9%。變形菌門的組成比例在椴樹紅松林土壤中最高(53.9%)，但在楓樺紅松林中比例最低(30.9%)。同時(shí)在3種林型中還含有少量的硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)和廣古菌門(Euryarchaeota)。它們?cè)诟髁中屯寥乐械慕M成比例在0.2%～0.9%。另外，在云冷杉紅松林和椴樹紅松林土壤中還含有少量擬桿菌門(Bacteroidetes)以及僅在椴樹紅松林中含有不足0.02%的厚壁菌門(Firmicutes)。采用Metastats分析進(jìn)一步確定不同原始紅松林之間豐度顯著差異的nirK型反硝化微生物(圖2)，在門水平上各林型之間豐度顯著性差異的物種有3個(gè)：擬桿菌門(Bacteroidetes)、廣古菌門(Euryarchaeota)和變形菌門(Proteobacteria)(圖2a、2b、2c)。云冷杉紅松林和椴樹紅松林土壤中nirK型反硝化微生物在門水平上豐度沒(méi)有顯著性差異，云冷杉紅松林和楓樺紅松林土壤中nirK型反硝化微生物中廣古菌門和擬桿菌門豐度差異顯著(P<0.05)，椴樹紅松林和楓樺紅松林土壤nirK型反硝化微生物中變形菌門豐度差異顯著(P<0.05)。

圖2 小興安嶺3種原始紅松混交林土壤中nirK型反硝化微生物門水平和屬水平的豐度顯著差異Fig.2 Soil nirK-type denitrifying microorganisms of three types of Pinus koraiensis mixed forest with significant difference of abundance at Phylum level and Genus level of Lesser Khingan Mountains

在屬水平上，取所有樣本中平均相對(duì)豐度前20位的菌群，將未鑒定和剩余的所有分類單元都?xì)w為“other”后作圖，觀察不同林型土壤nirK型反硝化群落分布變化情況(圖1b)。結(jié)果表明：在各樣本中，未知菌屬同樣占很大比例，在鑒定的已知菌屬中，組成比例在2%以上的菌屬有慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、固氮螺菌屬(Azospirillum)、伯霍爾德桿菌屬(Burkholderia)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)。其中慢生根瘤菌屬為核心菌屬，在各林型中組成比例在15%以上，云冷杉紅松林土壤中最高(30.6%)，楓樺紅松林土壤中最低(15.7%)。其他相對(duì)豐度大于0.3%的菌屬有Ralstonia屬，假單胞菌屬(Pseudomonas)、馬賽菌屬(Massilia)、Melaminivora屬、中生根瘤菌屬(Mesorhizobium)、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、葉桿菌屬(Pleomorphomonas)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)、中華根瘤菌屬 (Sinorhizobium)等。

在屬水平上3種原始紅松混交林樣地中nirK型反硝化微生物豐度顯著差異的物種有10個(gè)(圖2b—2m)：微枝形桿菌屬(Microvirga)、嗜鹽桿菌屬(Halobacterium)、葉桿菌屬(Pleomorphomonas)、無(wú)色桿菌屬(Achromobacter)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、Salinigranum屬、藤黃單胞菌屬(Luteimonas)、Melaminivora屬、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、布魯菌屬(Brucella)。其中微枝形桿菌屬、嗜鹽桿菌屬、葉桿菌屬、無(wú)色桿菌屬在云冷杉紅松林和椴樹紅松林中豐度差異顯著(P<0.05)；無(wú)色桿菌屬、葉桿菌屬、中華根瘤菌屬、Salinigranum屬、嗜鹽桿菌屬、藤黃單胞菌屬、Melaminivora屬、慢生根瘤菌屬在云冷杉紅松林和楓樺紅松林中豐度差異顯著(P<0.05)；然而，椴樹紅松林和楓樺紅松林土壤中，只有布魯菌屬豐度存在顯著差異(P<0.05)。其中，3種林型土壤中nirK型反硝化微生物組成比例最高的核心菌屬——慢生根瘤菌屬豐度以云冷杉紅松林最高，椴樹紅松林次之，楓樺紅松林最低，并且在云冷杉紅松林和楓樺紅松林之間差異顯著(P<0.05)。

2.3 原始紅松混交林土壤反硝化微生物群落的多樣性分析

3種原始紅松混交林土壤nirK型反硝化微生物α多樣性指數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，可以看出3種林型的α多樣性指數(shù)無(wú)顯著差異。

表3 小興安嶺3種林型原始紅松混交林土壤nirK型反硝化微生物的α多樣性指數(shù)Table 3 Alpha diversity index of soil nirK-type denitrifying microorganisms in three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains

圖3 小興安嶺3種林型原始紅松混交林樣地土壤nirK型反硝化微生物基于Bray-Curtis距離算法的樣本層級(jí)聚類樹Fig.3 Hierarchical clustering tree of soil nirK-type denitrifying microorganisms in four sampling plots of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains based on Bray-Curtis

基于Bray-Curtis距離算法對(duì)3種林型土壤nirK型反硝化微生物群落進(jìn)行樣本層級(jí)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3看出，椴樹紅松林和楓樺紅松林中土壤nirK型反硝化微生物群落相互交集，不能完全分開，表明椴樹紅松林和楓樺紅松林差異性較小，但它們都與云冷杉紅松林的樣本距離較遠(yuǎn)，表明云冷杉紅松林的土壤nirK型反硝化微生物群落與椴樹紅松林和楓樺紅松林差異性較大。采用基于Bray-Curtis距離算法的Anosim分析對(duì)組間群落相似性進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：3種原始紅松林土壤nirK型反硝化微生物群落組成差異顯著(R=0.25，P<0.05)，其中云冷杉紅松林與椴樹紅松林、楓樺紅松林之間差異均顯著(P<0.05)，但椴樹紅松林和楓樺紅松林土壤nirK型反硝化微生物組成相近，差異不顯著(P>0.05)，這與樣本層級(jí)聚類樹分析結(jié)果類似。

2.4 原始紅松混交林土壤反硝化微生物群落與土壤理化因子的關(guān)聯(lián)分析

WC.土壤含水量 soil water content；TOC.總有機(jī)碳 total organic carbon；TN.全氮 total nitrogen；TP.全磷total phosphorus；TOP.總孔隙度soil porosity；SBD.土壤容重soil bulk 硝態(tài)氮nitrate 銨態(tài)氮ammonium nitrogen。下同。The same below.圖4 小興安嶺3種林型原始紅松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落與土壤理化因子的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis(RDA)between soil physicochemical factors and soil nirK-type denitrifying microorganisms community of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains based on Bray-Curtis

采用冗余分析(redundancy analysis,RDA)探究影響3種原始紅松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落組成的環(huán)境因子。選擇9個(gè)對(duì)微生物群落有影響的土壤理化因子(pH、水分含量、土壤總孔隙度、土壤容重、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮)結(jié)合OTUs表格進(jìn)行分析。結(jié)果表明，銨態(tài)氮和全氮含量是顯著影響3種原始紅松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落組成的主要理化因子(P<0.05)。同時(shí)根據(jù)各理化因子在第一軸的投影顯示，銨態(tài)氮含量可能是影響3種原始紅松混交林土壤nirK型反硝化微生物群落組成的主要理化因子，其次為全氮含量(圖4)。采用Spearman相關(guān)性系數(shù)分析3種林型不同土壤理化因子與土壤nirK型反硝化微生物群落組成的相關(guān)性，豐度前20菌屬的相關(guān)性熱圖見(jiàn)圖5。由圖5看出，土壤nirK型反硝化微生物群落與土壤理化因子的相關(guān)性情況存在差異。其中與銨態(tài)氮含量呈顯著相關(guān)的菌屬最多達(dá)7個(gè)，分別是慢生根瘤菌屬、紅假單胞菌屬、無(wú)色桿菌屬、伯霍爾德桿菌屬、土壤桿菌屬、中華根瘤菌屬、Gramella屬。其次是硝態(tài)氮、全氮和總有機(jī)碳，與它們顯著相關(guān)的菌屬各有3個(gè)。

圖5 小興安嶺3種林型原始紅松混交林土壤理化因子和nirK型反硝化微生物群落相關(guān)性熱圖Fig.5 Correlation heatmap of soil physicochemical factors and soil nirK-type denitrifying microor-ganisms community of three types of primitive Pinus koraiensis mixed forest of Lesser Khingan Mountains

3 討 論

3.1 森林土壤nirK型反硝化微生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性

反硝化微生物廣泛分布于細(xì)菌和古菌中[8]，也發(fā)現(xiàn)部分真菌線粒體中有反硝化作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)3種原始紅松林土壤中參與反硝化作用包括細(xì)菌和古生菌，還發(fā)現(xiàn)許多未明確鑒定的nirK基因序列，在原始紅松林土壤中是否有反硝化作用的真菌，還需要對(duì)這些未知物種的nirK基因序列進(jìn)一步分析鑒定。在已有分類地位的nirK型反硝化微生物中，3種原始紅松林的土壤中nirK型反硝化微生物主要以變形菌門為主，變形菌門的組成比例在椴樹紅松林土壤中最高，然而在楓樺紅松林中比例最低。研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門的分布包括α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱和δ-變形菌綱，與Hou等[24]在施肥土壤中的研究結(jié)果類似，但在該研究中鑒定的nirK型反硝化微生物包括α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱。在屬水平上，組成比例在2%以上的菌屬有慢生根瘤菌屬、紅假單胞菌屬、固氮螺菌屬、伯霍爾德桿菌屬、無(wú)色桿菌屬，其中慢生根瘤菌屬為核心菌屬。但此次得到的nirK型反硝化菌群信息比以往更豐富[10,25]。

本研究發(fā)現(xiàn)3種林型土壤中nirK型反硝化微生物α多樣性指數(shù)無(wú)顯著性差異，這與已有研究結(jié)果一致[26-29]。如施肥[28-29]、土壤理化性質(zhì)的差異[26-27]和土壤管理方式的改變[10]未對(duì)nirK型反硝化微生物α多樣性指數(shù)產(chǎn)生顯著性影響。這是因?yàn)橥寥纍irK型反硝化微生物α多樣性與森林中優(yōu)勢(shì)植物種類有關(guān)[30-31]。這可能是不同植物的微環(huán)境土壤中nirK型反硝化微生物群落差異所致。同樣Barta等[32]報(bào)道，nirK型反硝化細(xì)菌在酸化的挪威云杉林土壤中更豐富。由于3種林型優(yōu)勢(shì)喬木均為紅松，伴生植物的不同導(dǎo)致了3種林型部分土壤理化性質(zhì)的差異，如銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。這些理化性質(zhì)的差異雖未對(duì)其α多樣性產(chǎn)生顯著性影響，但導(dǎo)致了β多樣性顯著差異，其中土壤銨態(tài)氮含量是影響3種林型nirK型反硝化微生物群落組成的主要理化因子，全氮含量其次。

3.2 森林土壤nirK型反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響因素