張晨晨 譚衛(wèi)國(guó) 郭卉欣 黃新春 陳燕梅 魏文靜

近年許多研究顯示，除受結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染影響外，結(jié)核病也可能是由復(fù)雜的微生物群落相互作用導(dǎo)致的[1]。早期肺結(jié)核患者呼吸道菌群的相關(guān)研究多是基于分離培養(yǎng)方法。但是到目前為止，人類(lèi)很難模擬各種微生物的原始生存環(huán)境，必然也不能真實(shí)地還原肺結(jié)核患者呼吸道本身微生物群系特點(diǎn)。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，極大的提升了對(duì)人呼吸道菌群的研究水平,如在新生兒感染性肺炎、嬰幼兒喘息、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、細(xì)菌性重癥肺炎和哮喘的研究方面都取得了一定的成果[2-6]。筆者利用16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)，比較了健康人群、結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(LTBI)者和活動(dòng)性肺結(jié)核患者的痰液菌群變化，初步研究了MTB感染對(duì)人痰液菌群結(jié)構(gòu)的影響，以為結(jié)核病防治工作提供參考。

對(duì)象和方法

1.研究對(duì)象：搜集2016年11月至2017年12月深圳市慢性病防治中心健康體檢者53名作為A組，其中，男14名(26.4%)，女39名(73.6%)，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為39.0(30.0，49.0)歲；選取同期該中心登記確診的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(tuberculin skin test，TST)硬結(jié)平均直徑≥10 mm和γ干擾素釋放試驗(yàn)(interferon gamma release assay，IGRA)均為陽(yáng)性的LTBI者41例作為B組，其中，男18例(43.9%)，女23例(56.1%)，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為45.0(31.5，54.0)歲；初治活動(dòng)性肺結(jié)核患者54例作為C組，其中，男36例(66.7%)，女18例(33.3%)，年齡中位數(shù)(四分位數(shù))為31.5(24.8，42.3)歲。

2.納入標(biāo)準(zhǔn)：WHO在2018年更新的《潛伏性結(jié)核感染管理指南》[7]中明確給出了LTBI檢測(cè)和治療人群的界定，活動(dòng)性肺結(jié)核的診斷參照《WS 288—2017 肺結(jié)核診斷》[8]。所有研究對(duì)象均符合以下納入標(biāo)準(zhǔn)：深圳市本地人口，作息、飲食規(guī)律，不酗酒嗜煙；無(wú)心、肝、肺、腎功能不全等重大疾?。粺o(wú)糖尿病、惡性腫瘤、HIV感染等。入組前所有研究對(duì)象均被告知研究?jī)?nèi)容后同意參加，并簽署知情同意書(shū)。本研究符合《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》和《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》的相關(guān)規(guī)定。

3.標(biāo)本采集：告知研究對(duì)象清晨空腹，用生理鹽水漱口后采用用力深咳方式，收集其下呼吸道痰液樣本(以干酪痰和黏液痰為佳)3～5 ml，共148份，立即放入-80 ℃冰箱保存，供后期集中提取細(xì)菌基因組DNA，用于測(cè)序分析。

4.基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增：使用糞便DNA微型試劑盒(批號(hào)：116570200；美國(guó)MP Biomedicals 公司)提取痰液樣品DNA。用正向引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對(duì)細(xì)菌16S rRNA的V4～V5可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將樣品特異性的7 bp條形碼納入引物中進(jìn)行多重測(cè)序。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系50 μl，包括：PCR 緩沖液 10 μl，dNTPs 10 μl，上下游引物各1.5 μl，Q5 High-Fidelity DNA 聚合酶 0.2 μl，模板DNA 40 ng，ddH2O補(bǔ)充至總體系50 μl。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用核酸純化試劑盒Agencourt AMPure Beads(批號(hào)：A63881；美國(guó)Beckman Coulter公司)純化，使用PicoGreen dsDNA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：P7581；美國(guó)Invitrogen公司)進(jìn)行定量分析。

5.16S rRNA宏基因組測(cè)序和數(shù)據(jù)處理：取等量純化后產(chǎn)物進(jìn)行Illlumina MiSeq平臺(tái)高通量測(cè)序(上海派森諾生物科技有限公司)。使用微生物生態(tài)學(xué)軟件(QIIME 2 2019.10)對(duì)細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增子數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。使用FastQC v.0.11.2和Trimmomatic v.0.32對(duì)序列進(jìn)行質(zhì)量控制和過(guò)濾，然后使用QIIME 2內(nèi)帶的DADA2軟件對(duì)序列reads進(jìn)行過(guò)濾，構(gòu)建特征表。采用q2-feature-classifier模塊(QIIME 2 2019.10)對(duì)每個(gè)16S rRNA基因序列進(jìn)行分類(lèi)。采用預(yù)訓(xùn)練的樸素貝葉斯分類(lèi)器gg-13-8-99-515-806-nb-classifier進(jìn)行聚類(lèi)分析，得到樣本在不同分類(lèi)水平上的菌群的相似性和差異性。

6.生物信息學(xué)分析：應(yīng)用QIIME 2、Python(v3.7)和R軟件(v3.6.3)進(jìn)行序列數(shù)據(jù)分析。采用q2-diversity模塊(QIIME 2 2019.10)進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析。Alpha多樣性有多重衡量指標(biāo)及測(cè)量方法，通過(guò)Shannon、Simpson、Chao1、Pielou_e和Observed_otus 5個(gè)指標(biāo)來(lái)表示[9]。其中，Shannon指數(shù)是菌群豐富度和均衡度的量化指標(biāo)，對(duì)豐富性更敏感，值越大，樣本多樣性越大；Simpson指數(shù)和Observed_otus是對(duì)菌群豐富度的定性測(cè)量，值越大，樣本多樣性越大；Chao1指數(shù)代表菌群豐富度指數(shù)，其值越大，表明物種總數(shù)越多；Pielou_e指數(shù)是菌群均勻度的衡量標(biāo)準(zhǔn)，值越高，菌群的均勻度越大。Beta多樣性反映不同樣品在物種多樣性方面的相似程度[10]，組間兩兩比較的Bray-Curtis距離差異采用非參數(shù)多元方差分析(PerMANOVA檢驗(yàn))。比較不同分類(lèi)水平各物種的相對(duì)豐度，描述菌群組成結(jié)構(gòu)的差異，然后通過(guò)線性判別分析效應(yīng)量(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)找出三組在各分類(lèi)水平有明顯差異的細(xì)菌，用線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)評(píng)估各組間各分類(lèi)水平差異菌的效應(yīng)大小，該研究設(shè)定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的LDA 值為2，尋找兩組間具有明顯差異的物種[11-12]。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料為偏態(tài)分布，以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”表示，各組微生物多樣性指數(shù)比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 16S rRNA 測(cè)序結(jié)果分析：通過(guò)高通量測(cè)序，對(duì)3個(gè)組的148份樣本的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得14 136 502.0條有效序列，A、B和C三組有效序列中位數(shù)(四分位數(shù))分別為104 296.0(85 553.0，123 168.0)條、108 578.0(91 821.0，123 309.0)條和120 523.0(113 297.5，128 367.5)條。根據(jù)97%的相似度進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OTU)聚類(lèi)，獲得21 712.00個(gè)OTU，A、B和C三組OTU數(shù)的中位數(shù)(四分位數(shù))分別為150.00(120.00，163.50)、137.00(114.50，167.50)和143.00(122.00，179.25)個(gè)，各組間OTU數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=0.440，P=0.803)。每份樣本的測(cè)序覆蓋率(coverage)均>99%，說(shuō)明測(cè)序數(shù)目足夠，測(cè)序序列可以代表其菌群組成。

2.菌群Alpha多樣性分析：對(duì)以上測(cè)序數(shù)據(jù)，首先利用Alpha多樣性分析法對(duì)不同組別間的菌群豐富度和均衡度進(jìn)行分析，基于OTU種類(lèi)和豐度計(jì)算Shannon、Simpson、Chao1、Pielou_e和Observed_otus指數(shù)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)三組研究對(duì)象間呼吸道菌群多樣性指數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)A組和C組的Pielou_e指數(shù)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=4.462，P=0.035)，說(shuō)明健康人群和活動(dòng)性肺結(jié)核患者呼吸道菌群的均勻度有明顯差異。

3.菌群Beta多樣性分析：Beta多樣性反映了各樣本間菌群的整體差異程度，圖中兩點(diǎn)之間的距離越大表示兩者間的群落構(gòu)成差異越大?；贐ray-Curtis距離指標(biāo)分析(圖1)，可見(jiàn)A、B、C組研究對(duì)象整體菌群組成存在一定的差異(H=2.027，P=0.002)。

4.菌群結(jié)構(gòu)組成：統(tǒng)計(jì)不同分類(lèi)水平上各微生物的豐度(圖2)，結(jié)果顯示，門(mén)水平上，三組樣本中物種相對(duì)豐度較高的均為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)。其中，B組厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的相對(duì)豐度為20.4%，較A組(24.6%)和C組(25.3%)減少；與A組(10.2%)和B組(10.3%)相比，C組梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)相對(duì)豐度(5.5%)明顯減少。屬水平上，相對(duì)豐度較高的屬有20種，C組中卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)相對(duì)豐度為3.5%，纖毛菌屬(Leptotrichia)相對(duì)豐度為1.7%，均比A組(8.0%和4.2%)和B組(8.0%和2.9%)減少；與A組(5.9%)和C組(3.7%)相比，B組梭桿菌屬(Fusobacterium)相對(duì)豐度(7.3%)增加。在綱、目、科水平上，三組間不同物種的相對(duì)豐度也均有變化。

圖2a表示門(mén)水平；圖2b表示綱水平；圖2c表示目水平；圖2d表示科水平；圖2e表示屬水平；A組為健康組，B組為結(jié)核分枝桿菌潛伏感染組，C組為活動(dòng)性肺結(jié)核組

5.不同分類(lèi)水平上菌群組間差異物種分析：選取樣本中相對(duì)豐度>1%的物種進(jìn)行分析，用柱形圖進(jìn)行可視化展示(圖3)，在不同分類(lèi)水平上篩選三組中豐富度變化差異較大的菌種，其中涉及3個(gè)門(mén)(厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、螺旋體門(mén))、3個(gè)綱(黃桿菌綱、梭桿菌綱、螺旋體綱)、5個(gè)目(黃桿菌目、乳桿菌目、梭桿菌目、伯克霍爾德菌目、螺旋體目)、6個(gè)科(紫單胞菌科、黃桿菌科、梭桿菌科、纖毛菌科、伯克菌科、螺旋體科)、5個(gè)屬(二氧化碳噬纖維菌屬、卟啉單胞菌屬、梭桿菌屬、纖毛菌屬、密螺旋體屬)和2個(gè)種(Nanceiensis和Parvula)。C組中梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)[0.04(0.02，0.08)]、梭桿菌綱(Fusobacteriia)[0.04(0.02，0.08)]、梭桿菌目(Fusobacteriales)[0.04(0.02，0.08)]、梭桿菌科(Fusobacteriaceae)[0.02(0.01，0.05)]、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)[0.03(0.01，0.05)]、梭桿菌屬(Fusobacterium)[0.02(0.01，0.05)]和卟啉單胞菌屬(Porphyromonas)[0.03(0.01，0.05)]的豐富度較A組[豐富度分別為0.08(0.06，0.12)、0.08(0.06，0.12)、0.08(0.06，0.12)、0.04(0.03，0.06)、0.07(0.04，0.10)、0.05(0.03，0.06)、0.07(0.04，0.10)]和B組[豐富度分別為0.09(0.06，0.12)、0.09(0.06，0.12)、0.09(0.06，0.12)、0.05(0.03，0.08)、0.07(0.04，0.10)、0.05(0.03，0.09)、0.08(0.04，0.10)]明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(C組與A組比較：H值分別為14.780、14.780、14.732、11.489、24.910、11.321、25.726，P值均<0.01；C組與B組比較：H值分別為16.221、16.221、16.281、13.390、26.416、13.501、27.196，P值均<0.01)。而C組中伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)[0.01(0.00，0.02)]和伯克菌科(Burkholderiaceae)[0.01(0.00，0.01)]的豐富度較A組[豐富度分別為0.00(0.00，0.01)和0.00(0.00，0.00)]和B組[豐富度分別為0.00(0.00，0.01)和0.00(0.00，0.00)]則明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(C組與A組比較：H值分別為9.733和4.799，P值分別為0.002和0.028；C組與B組比較：H值分別為12.134和8.152，P值均<0.01)。

圖中星號(hào)表示組間豐富度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P<0.05，**P<0.01)

討 論

既往研究認(rèn)為，健康人的肺部是無(wú)任何細(xì)菌的，但隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)在細(xì)菌的鑒定與分類(lèi)研究中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，并發(fā)現(xiàn)健康人的肺部存在多種微生物[6]。16S rRNA基因普遍存在于細(xì)菌細(xì)胞，在細(xì)菌基因組中位于核糖體小亞基，含有10個(gè)保守區(qū)域(conserved regions)和9個(gè)高變區(qū)域(variable regions)，具有良好的進(jìn)化保守性和適宜的分析長(zhǎng)度(約1540 bp)，以及與進(jìn)化距離相匹配的良好變異性。因此，16S rRNA被認(rèn)為是細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究和細(xì)菌分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)識(shí)序列[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，健康人群、LTBI者和活動(dòng)性肺結(jié)核患者的OTU數(shù)目無(wú)明顯差別。通過(guò)Alpha多樣性分析可知，MTB感染未改變?nèi)梭w痰液樣本的物種豐富度，但是卻造成活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰液樣本中物種均勻度的變化。2012年，Cui等[15]發(fā)現(xiàn)結(jié)核病患者痰液微生物群比健康人更多樣化，與筆者研究結(jié)果存在差異。菌群結(jié)構(gòu)組成分析顯示，門(mén)水平上，健康人群、LTBI者和活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰樣本中的優(yōu)勢(shì)菌群均為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)，只是在各組中相對(duì)豐度有所變化?；顒?dòng)性肺結(jié)核患者痰樣本中，相對(duì)豐度較高的前4位菌屬分別為奈瑟菌屬(Neisseria)、普氏菌屬(Prevotella)、鏈球菌屬(Streptococcus)和韋榮球菌屬(Veillonella)。而2016年Krishna等[16]研究表明，鏈球菌屬(Streptococcus)、奈瑟菌屬(Neisseria)和韋榮球菌屬(Veillonella)是印度結(jié)核病患者痰液菌群的3個(gè)優(yōu)勢(shì)屬，他們還發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)是結(jié)核病患者的主要門(mén)，而擬桿菌門(mén)(Bacteroides)和變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)在對(duì)照組(健康人群)中較高[16]。另外，2013年Cheung 等[17]比較了結(jié)核病患者和具有結(jié)核病類(lèi)似咳嗽癥狀但痰菌培養(yǎng)陰性的對(duì)照人群之間的痰液菌群差異，發(fā)現(xiàn)這兩類(lèi)人群的菌群多樣性類(lèi)似，放線菌屬(Actinomyces)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、普氏菌屬(Prevotella)、鏈球菌屬(Streptococcus)和韋榮球菌屬(Veillonella)是結(jié)核病患者痰液菌群的核心菌屬。這三項(xiàng)研究表明，不同地域的結(jié)核病患者痰樣本中優(yōu)勢(shì)菌群可能存在差異性。

不同分類(lèi)水平上菌群組間差異物種分析發(fā)現(xiàn)，活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰樣本中伯克霍爾德菌目(Burkholderiales)和伯克菌科(Burkholderiaceae)的相對(duì)豐度較健康人群和LTBI者明顯增加。因?yàn)槁耘懦夥磻?yīng)，肺移植者的長(zhǎng)期存活率很低，2013年Borewicz等[18]研究發(fā)現(xiàn)，肺移植者的肺部菌群與健康人最明顯的差異是伯克菌科(Burkholderiaceae)的出現(xiàn)。青枯菌屬(Ralstonia)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和已知的肺部病原體伯克菌屬(Burkholderia)都屬于伯克菌科(Burkholderiaceae)。而青枯菌屬(Ralstonia)[19-20]、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)[21]、細(xì)桿菌屬(Microbacterium)[22-23]和貪銅菌屬(Cupriavidus)[21]均與呼吸道感染、菌血癥和院內(nèi)感染有關(guān)。正常情況下，微生物菌群處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，參與能量代謝，維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。它們?cè)谝浦不颊叻尾康拇嬖?，與它們?cè)诩膊≈邪l(fā)揮潛在作用或使有效的肺清除機(jī)制缺乏是一致的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，失衡的肺部菌群對(duì)免疫細(xì)胞亞群數(shù)量及功能的干擾、紊亂失調(diào)的免疫細(xì)胞弱表達(dá)或不表達(dá)重要病原體識(shí)別受體和結(jié)核毒性細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)正常免疫功能的菌種被削弱或耗盡、正常菌群代謝產(chǎn)生的短鏈脂肪酸和吲哚丙酸減少等可能是導(dǎo)致結(jié)核病的致病機(jī)制[24]。

綜上所述，本研究通過(guò)比較健康人群、LTBI者和活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰液菌群結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)了三者在不同分類(lèi)水平上具有明顯差異的物種。但是由于本次研究對(duì)象數(shù)量較少，研究結(jié)果具有一定的局限性，后續(xù)還需擴(kuò)大研究對(duì)象數(shù)量以進(jìn)一步探索和明確健康人群、LTBI者和活動(dòng)性肺結(jié)核患者的菌群特征，了解MTB感染對(duì)呼吸道菌群的確切影響。