向 益，王 利，魏 勇，張 樺

(1.西南民族大學青藏高原動物遺傳資源保護與利用教育部和四川省重點實驗室，四川成都 610041；2.四川省畜牧科學研究院獸醫(yī)研究所，四川成都 610041)

腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)是一種革蘭氏陽性、凝固酶陰性、非溶血性球菌[1]。腐生葡萄球菌可以引發(fā)急性膀胱炎、腎盂腎炎[2]、心內膜炎[3]、結膜炎[4]、乳腺炎等病癥，同時也可引起傷口感染及水產品腐敗變質。此外，腐生葡萄球菌可作為馬飼料添加劑，減少馬糞溫室氣體的排放[5]；能高效處理高鹽堿性三苯甲胺類廢水；能在發(fā)酵肉制品的制作中發(fā)揮作用。近年來，腐生葡萄球菌已成為醫(yī)源性感染的常見病原菌，并隨著抗生素的濫用，導致腐生葡萄球菌具有多重耐藥的趨勢。目前已從魚類、奶牛、腌肉制品、人胃腸道等中被分離鑒定腐生葡萄球菌，但未見從羊中分離到腐生葡萄球菌的報道。四川某羊場羊只突發(fā)死亡，從心臟中分離培養(yǎng)得到1株腐生葡萄球菌，命名為S.S QJ-01，對其進行常規(guī)鑒定及分子生物學鑒定以及藥敏試驗，旨在為該菌的后續(xù)研究提供指導，為該菌引起的疾病的防治提供科學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 四川某羊場突發(fā)死亡病羊，其體型消瘦，眼、鼻均有白色滲出物，剖檢發(fā)現(xiàn)其肝臟、腎臟腫大、充血，心臟表面有出血點。無菌采集心臟、肝臟、腎臟作為細菌分離的病料。

1.1.2 主要試劑 LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和Mueller-hinton agar培養(yǎng)基均購自青島高科園海博生物技術有限公司；1.1×T3 Super PCR Mix、DNA Marker DL 2 000、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；16種葡萄球菌常用生化鑒定管和藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司；標準革蘭氏染色試劑盒購自北京雷根生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；PCR儀購自Eppendorf Germany公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離及形態(tài)觀察 無菌接種環(huán)采集病羊心臟、肝臟、腎臟樣品，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)20 h，挑取單菌落于平板純化3次，挑取顏色、形狀相近的單菌落經3次液體LB肉湯培養(yǎng)基傳代后用50%甘油保種備用。進行革蘭氏染色鑒定，用草酸銨結晶紫初染、碘液媒染、950 mL/L乙醇脫色、番紅染色液復染，干燥后于光學顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.2 生理生化 鑒定參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)[1]中細菌鑒定的方法，采用細菌微量生化鑒定管對待測菌株S.S QJ-01進行各項生化指標的測定，并利用杭州微生物試劑有限公司提供的《葡萄球菌生化鑒定編碼冊》對結果進行判定。

1.2.3 引物的設計與合成 參照文獻[6]設計細菌16S rDNA基因引物、aac(6′)-Ⅰb和aac(3)-Ⅱa氨基糖苷類抗生素耐藥基因引物、Sul1、Sul2和Sul3磺胺類抗生素耐藥基因引物、TEMβ-內酰胺類抗生素耐藥基因引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 細菌基因組DNA提取 按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株S.S QJ-01的總DNA，其濃度及質量于紫外分光光度計檢測合格后(D260nm/D280nm=1.8-2.0),置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 16S rDNA基因PCR擴增及系統(tǒng)進化樹構建 采用16S rDNA基因引物進行PCR擴增，PCR擴增條件為：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸2 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果并拍照。PCR產物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序拼接。將測序結果與已知GenBank數(shù)據(jù)庫中核苷酸序列進行Blast比對，通過Neihbor-Joining方法，構建菌株S.S QJ-01的系統(tǒng)進化樹。采用MEGA6.0軟件對以上序列進行同源性分析。

1.2.6 小鼠致病性試驗 從四川省成都市中醫(yī)藥研究所購買健康昆明雌鼠10只，體重約為25 g～28 g，正常飼喂7 d后，隨機分為對照組和試驗組，每組5只。將接種于LB肉湯液體培養(yǎng)基的菌株S.S QJ-01置于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，隨后12 000 r/min離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水清洗2次，制備成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液。用無菌注射器抽取0.2 mL的菌懸液，對小鼠進行腹腔注射，對照組注射等量的無菌生理鹽水，每隔2 h觀察記錄，對死亡小鼠進行剖檢，并對其體內病原菌進行分離鑒定。取其肺、肝、腎、脾臟樣品經40 g/L多聚甲醛固定，制備成組織切片，經HE染色后，在光學顯微鏡下觀察病理變化。對照組小鼠于第7天處死，取相應臟器制作組織切片。

1.2.7 耐藥基因檢測 以提取的菌株S.S QJ-01總DNA為模板，PCR擴增各種耐藥基因。PCR擴增條件為：98℃ 2 min；98℃ 10 s，50℃～65℃ 15 s，72℃ 30 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸2 min。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察耐藥基因擴增條帶是否與目的條帶一致。

1.2.8 藥敏試驗 采用K-B紙片法進行藥敏試驗，參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準《紙片法抗菌藥物敏感試驗標準(WS/T 125-1999)》及美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)標準與指南判定結果。將保種的菌株S.S QJ-01接種于滅菌生理鹽水中，調整菌液濃度為0.5麥氏單位。取少量菌液均勻涂布于MH瓊脂平板，將藥敏片緊貼在平板表面，于35℃培養(yǎng)20 h后測定抑菌圈直徑。

2 結果

2.1 細菌分離及形態(tài)觀察

菌株S.S QJ-01在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h后，形成不透明、圓形凸起、邊緣整齊、乳白色小菌落。革蘭氏染色鏡檢，菌株S.S QJ-01被染成紫色，形態(tài)為球狀，串狀排列，表明菌株S.S QJ-01為革蘭氏陽性菌。

2.2 細菌生化鑒定

菌株S.S QJ-01能發(fā)酵蔗糖、蕈糖、乳糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺；不發(fā)酵甘露糖、蜜二糖、木糖、山梨醇、木糖醇。尿素酶試驗、乙酰甲基甲醇試驗(V-P)、甲基紅試驗(MR)陽性；精氨酸雙水解酶試驗陰性，不還原硝酸鹽。結果顯示，該菌株與腐生葡萄球菌具有相似的生化特性。

2.3 細菌16S rDNA鑒定

菌株S.S QJ-01的16S rDNA基因經PCR擴增獲得1 465 bp的片段，與預期相符(圖1)。采用Blast將測序拼接后的菌株S.S QJ-01 16S rDNA基因序列進行比對分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，菌株S.S QJ-01與腐生葡萄球菌ATCC15305菌株同源性為99.50 %，與腐生葡萄球菌GTC843菌株同源性為98.10 %。在系統(tǒng)發(fā)育樹中菌株S.S QJ-01與腐生葡萄球菌GTC843菌株位于同一分支(圖2)。因此，綜合形態(tài)學觀察及分子生物學鑒定，可判定菌株S.S QJ-01為腐生葡萄球菌。

M.DNA 標準 DL 2 000；1～2.菌株S.S QJ-01 16S rDNA擴增產物

圖2菌株S.S QJ-01的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 小鼠致病性試驗

菌株S.S QJ-01感染小鼠8 h后，試驗組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、被毛凌亂、弓背等癥狀，12 h后，試驗組小鼠開始死亡。對死亡小鼠進行細菌分離鑒定，結果表明分離的致病菌為腐生葡萄球菌。剖檢可見死亡小鼠肺臟充血、出血；肝臟呈暗紅色、充血；脾臟淤血呈黑色；心臟和腎臟未見明顯病理變化。對照組小鼠未見異常變化。組織切片顯示，肺泡壁毛細血管擴張、充血，肺泡壁充滿紅細胞(圖3A)；肝細胞變性，肝竇擴張、充血，中央靜脈充血，淋巴細胞浸潤(圖3B)；腎小球萎縮、充血，腎小管上皮細胞壞死、核固縮、甚至消失，管腔狹窄(圖3C)；脾臟紅髓區(qū)充滿大量紅細胞，淀粉樣變性(圖3D)。表明菌株S.S QJ-01具有較強致病性。

A.肺臟；B.肝臟；C.腎臟；D.脾臟A.Lung; B.Liver; C.Kidney; D.Spleen

2.5 耐藥基因檢測

菌株S.S QJ-01的耐藥基因PCR擴增結果顯示，β-內酰胺類TEM耐藥基因陽性，大小約為719 bp；氨基糖苷類aac(6′)-Ⅰb耐藥基因陽性，大小約為486 bp，氨基糖苷類aac(3)-Ⅱa耐藥基因陽性，大小約為384 bp；磺胺類耐藥基因中Sul2耐藥基因陽性，大小約為793 bp，Sul1和Sul3耐藥基因陰性(圖4)。

M.DNA 標準 DL 2 000；1.TEM 基因; 2.aac(6′)-Ⅰb基因; 3.aac(3)-Ⅱa基因；4.Sul1基因; 5.Sul2基因; 6.Sul3基因 7.陰性對照

2.6 藥敏試驗結果

對菌株S.S QJ-01進行抗生素敏感性檢測，結果顯示其對頭孢唑林、環(huán)丙沙星、復方新諾明、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考等12種抗生素敏感；對青霉素、克林霉素、多黏菌素E等7種抗生素耐藥(表1)。

3 討論

腐生葡萄球菌作為一種條件致病菌，廣泛存在自然界中，在特定條件下可引起人和動物感染發(fā)病。目前，已分別從狐貍[7]、雞肉[8]、腐敗鯧魚、土壤[9]中分離鑒定出腐生葡萄球菌。腐生葡萄球菌作為泌尿生殖道感染的常見病原菌，還常從生殖道樣本中被分離。在引起人和動物疾病方面僅有少量報道，該菌能引起人腎盂腎炎[2]、兒童下呼吸道感染、奶牛乳腺炎。此外，該菌還可引起人結膜炎、心內膜炎等病癥。Hiroki M[3]等報道了人下消化道感染腐生葡萄球菌引起菌血癥并發(fā)急性心內膜炎的病例，并在血液中分離到了腐生葡萄球菌。說明該菌主要通過血液系統(tǒng)在動物機體內傳播，導致各器官急性轉移性感染，這也可能成為試驗小鼠急性死亡的原因。本研究從湖羊中分離鑒定出腐生葡萄球菌菌株S.S QJ-01，該菌株主要引起小鼠肺部炎癥以及脾臟炎癥，心臟的病變并不明顯。這可能是由于不同菌株和宿主感染部位的不同所致。所以，在臨床中應注意感染方式的不同對動物各臟器造成的損害程度有所差異。

表1菌株S.S QJ-01的藥敏試驗結果

耐藥基因在各物種間廣泛傳播，使細菌產生多重耐藥，研究細菌的耐藥基因有助于理解耐藥表型與基因型的關系，并為臨床藥物的使用提供參考。TEM基因屬于超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)基因，含有β-內酰胺酶的細菌可以解開β-內酰胺類抗生素中的β-內酰胺環(huán)，使抗生素失效。氨基糖苷耐藥的方式主要以酶修飾失活為主，干擾抗生素與核糖酰-tRNA親和力降低，使抗生素失活[10]。磺胺類抗生素(SAs)的耐藥機制是產生低親和力的二氫葉酸合成酶，從而降低細菌對磺胺類藥物的敏感性。TEM耐藥基因已在魚源哈維弧菌[11]和雞源致病性大腸埃希氏菌中被檢出。aac(6′)-Ⅰb和aac(3)-Ⅱa耐藥基因已在人源肺炎克雷伯菌[12]、水貂銅綠假單胞菌中被檢出。Sul2耐藥基因已在狐貂源大腸埃希氏菌[13]和魚源門多薩假單胞菌[6]中被檢出。目前，尚未見腐生葡萄球菌中關于耐藥基因的報道。本研究在羊源腐生葡萄球菌中檢出了TEM、aac(6′)-Ⅰb、aac(3)-Ⅱa和Sul2共4種耐藥基因。由此可見，這些耐藥質粒存在于不同種類的細菌之中，耐藥基因在不同物種、不同細菌之間廣泛轉移導致多種細菌對抗生素產生耐藥，耐藥性的產生除與地區(qū)或養(yǎng)殖場藥物使用頻繁程度有關外，還與耐藥基因的轉移、變異有著密切的聯(lián)系。

近年來，關于腐生葡萄球菌的藥敏試驗報道尚少。有研究檢測到36株人源腐生葡萄球菌對氨基糖苷類藥物(慶大霉素、妥布霉素等)敏感率為100%[14]，對苯唑西林、青霉素耐藥，對頭孢噻吩敏感[15]，對慶大霉素、鏈霉素耐藥[4]。本研究藥敏試驗結果顯示，羊源腐生葡萄球菌菌株S.S QJ-01對環(huán)丙沙星、慶大霉素、妥布霉素等抗生素敏感，這一結果與文獻[4]結果不一致，可能是菌株分離源不同或者與該羊場對此類抗生素使用較少有關。

本研究對從羊源分離到的菌株S.S QJ-01進行了常規(guī)鑒定及生物學特性分析，確定該菌為腐生葡萄球菌。該菌對小鼠具有較強致病性，對頭孢唑林、環(huán)丙沙星、復方新諾明等敏感，對青霉素、克林霉素、多黏菌素E等耐藥。臨床中可根據(jù)藥敏試驗，優(yōu)先使用慶大霉素、妥布霉素、頭孢噻吩等藥物治療由腐生葡萄球菌引起的感染。