鄒導夫，吉藝寬，李美娣

（梅州職業(yè)技術學院，廣東梅州 514011）

大腸桿菌（Escherichia coli）學名大腸埃希氏菌，在養(yǎng)雞業(yè)中長期存在，各種日齡的雞均可感染，其中2～4周齡雛雞易感性最高，發(fā)病時表現(xiàn)為急性敗血癥狀，病死率較高[1-2]。由于耐藥菌株的出現(xiàn)，大腸桿菌病已成為養(yǎng)雞業(yè)中的重要挑戰(zhàn)[3]，其治療過程中難以針對性用藥，增加用藥成本，造成不必要的經(jīng)濟損失。

大腸桿菌的血清型較多[4-5]，目前無法用疫苗進行預防控制，發(fā)病后通常使用抗生素進行治療。由于長期使用抗生素，大腸桿菌耐藥性普遍且耐藥譜不斷擴大[6-7]，導致有效治療藥物日漸減少，增加治療的難度。本研究通過對廣東某養(yǎng)雞場疑似大腸桿菌致死雞進行細菌分離鑒定，并進行藥敏試驗，為該場大腸桿菌病的綜合防控提供基礎依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

廣東博羅地區(qū)某養(yǎng)雞場在30 日齡前后爆發(fā)細菌性疾病，出現(xiàn)腹瀉癥狀，每日死亡率約1%。剖檢死雞可見包心、包肝等現(xiàn)象，使用多種抗生素均無效。采集30日齡病死雞肝臟。

梅州地區(qū)某養(yǎng)雞場40日齡開始出現(xiàn)輕微的拉稀癥狀。經(jīng)剖檢未見包心、包肝等現(xiàn)象，未用抗生素，采集40日齡病死雞肝臟。

1.2 試驗試劑

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、MH 瓊脂培養(yǎng)基、LB 肉湯培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏片紅霉素（15 μg/片）、青霉素（10 u/片）、氨芐西林（10 μg/片）、頭孢唑林（30 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、諾氟沙星（10 μg/片）、環(huán)丙沙 星（5 μg/片）、復 方 新 諾 明（23.75 μg/片）、氯 霉 素（30 μg/片）、丁胺卡那霉素（30 μg/片）購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 儀器設備

SW-CJ-2F超凈工作臺（蘇州真田潔凈設備有限公司）、SYQ-DSX-280A高壓蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、THZ-92B恒溫震蕩搖床（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、CX21 雙目顯微鏡[奧林巴斯（中國）有限公司]、HPX-9272MBE恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）、101-3鼓風干燥箱（上海蘇進儀器設備廠）、TGL-16G離心機（上海安亭科學儀器廠）、Life Express PCR擴增儀（杭州博日基因擴增儀）、DYY-6C電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 大腸桿菌的分離純化

1.4.1 分離培養(yǎng)

新鮮肝臟在火焰上消毒，用無菌接種針插入肝臟，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，根據(jù)大腸桿菌在麥康凱上的生長特性，挑取單個粉紅色可疑單菌落繼續(xù)劃線于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。

1.4.2 革蘭氏染色鏡檢

將疑似菌株進行革蘭氏染色鏡檢，于顯微鏡下觀察細菌的形態(tài)。

1.5 分子生物學鑒定

1.5.1 引物設計與合成

參考毛福超等[8]設計大腸桿菌特異性擴增引物進行合成，其上游引物序列為：EC370-F：5'-GATAAG CCCGCAGTCACCT-3'，下游引物序列為：EC370-R：5'-TCCCGTAACTCATCACCATCA-3'，預計擴增片段大小為370 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5.2 可疑菌株DNA提取

挑取經(jīng)鏡檢的可疑菌落，接種于LB 肉湯中，于（36±1）℃震蕩培養(yǎng)18～24 h得出新鮮菌體培養(yǎng)物，以大腸桿菌44102 株做陽性對照，無菌水作陰性對照，進行DNA提取。提取步驟：吸取1 mL菌液于1.5 mL無菌離心管中，以12 000 r/min 離心1 min，棄去上清液，用無菌去離子水反復洗滌2 次，后100 μL 無菌水重懸，置于沸水浴中煮沸20 min，于12 000 r/min離心1 min，取上清液做DNA模板。

1.5.3 PCR擴增和凝膠電泳

參照TaKaRa Premix Taq Version 2.0 使用說明書，將Premix Taq 12.5 μL、DNA 模板1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、無菌蒸餾水9.5 μL準確量取加入PCR管中，吹打混勻。各組分充分混勻后，設置PCR擴增反應為：95 ℃預變性5 min、95 ℃變性30 s、61 ℃復性30 s、72 ℃延伸55 s 和72 ℃后延伸10 min，其中95 ℃變性、61 ℃復性和72 ℃延伸設定30個循環(huán)。取樣品10 μL立刻進行瓊脂糖凝膠電泳（電壓150 V，電泳時間25 min），在凝膠成像系統(tǒng)讀取結果，測序。

1.6 藥敏試驗

參照常規(guī)K-B 藥敏紙片擴散法對分離的菌株進行紅霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復方新諾明、氯霉素、慶大霉素和丁胺卡那霉素的藥敏試驗。取大腸桿菌新鮮培養(yǎng)肉湯，調(diào)整菌液濃度為1.0×106CFU/mL，用移液槍吸取100 μL 加入LB 瓊脂平板，采用無菌玻璃棒涂布均勻，放置5～10 min，待平板水分被完全吸收后，使用鑷子取藥敏紙片，貼于平板表面，輕輕按壓使其貼平，重復2 個平行，置于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察結果，使用游標卡尺測量抑菌圈大小，并做好記錄。結果判斷參照SN/T 1944—2016《動物及其制品中細菌耐藥性的測定——紙片擴散法》[9]。

2 結果與分析

2.1 細菌的分離培養(yǎng)及鏡檢結果（見圖1、圖2）

圖1 麥康凱培養(yǎng)基培養(yǎng)結果Fig.1 Culture results of strains on McConnell medium

由圖1可知，分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基上呈淺紅色、菌落中心顯桃紅色、圓形濕潤、表面光滑、邊緣整齊、菌落周圍麥康凱培養(yǎng)基變成粉紅色。

圖2 革蘭氏染色鏡檢結果Fig.2 Microscopic examination results of Gram stain

由圖2可知，革蘭氏染色后，在顯微鏡下可見菌株為革蘭氏陰性菌，呈紅色短桿菌，中等大小、兩頭鈍圓，未見莢膜和芽孢，初步分離得到2 株大腸桿菌分離株，并命名為ECGD2010-1和ECGD2010-2株。

2.2 PCR擴增鑒定結果（見圖3）

由圖3可知，從平板挑取菌落接入肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)提取菌株DNA作為模板，用大腸桿菌引物進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后，與DL5000 DNA Marker 和DL2000 DNA Maker 做比較，發(fā)現(xiàn)擴增片段在400～500 bp 之內(nèi)，與陽性對照所處位置一致，和預期目的片段長度相符，條帶單一光亮。經(jīng)測序后比對結果，顯示所分離菌株序列與大腸桿菌的同源性分別為99.0%和98.9%。

2.3 藥敏試驗結果（見圖4）

由圖4 可知，ECGD2010-1 菌株對紅霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢唑林、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、復方新諾明、氯霉素表現(xiàn)為耐藥，僅對慶大霉素和丁胺卡那霉素表現(xiàn)為敏感；ECGD2010-2 菌株僅對氨芐西林表現(xiàn)為耐藥，對青霉素、諾氟沙星、紅霉素、頭孢唑林、慶大霉素、環(huán)丙沙星、復方新諾明、氯霉素、丁胺卡那霉素均表現(xiàn)為敏感。

圖3 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis

圖4 藥敏試驗結果Fig.4 Drug sensitivity test results of strain

3 討論

廣東省是養(yǎng)禽大省。每年由于大腸桿菌感染導致的經(jīng)濟損失巨大，其中主要是因為大腸桿菌的血清型較多。目前尚未有商品化疫苗上市，無法對其進行預防控制，發(fā)病后通常使用抗生素進行治療。長期大量使用抗生素引起細菌耐藥性[10]，且耐藥譜不斷擴大[6-7]，導致有效治療藥物日漸減少，從而增加治療的難度和成本。因此，對大腸桿菌臨床流行病學檢查及耐藥性監(jiān)測是大腸桿菌病綜合防控的關鍵手段之一。此外，在用藥方面，需要通過交叉用藥、聯(lián)合用藥等方式，避免耐藥性產(chǎn)生，從而達到綜合防控的目的。

本試驗結果顯示，分離自廣東博羅地區(qū)某雞場的大腸桿菌菌株對青霉素等均表現(xiàn)為耐藥，僅僅對慶大霉素和丁胺卡那霉素敏感，藥敏試驗結果與主訴結果基本相同。分離自廣東梅州地區(qū)某雞場的大腸桿菌菌株僅對氨芐西林表現(xiàn)耐藥，而對其他抗生素均表現(xiàn)為敏感。經(jīng)分離鑒定，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上可見粉紅色或者淺粉色圓形菌落，表面光滑，直徑1～3 mm，符合大腸桿菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的菌落特征。進一步做革蘭氏染色鏡檢鑒定，結果顯示為革蘭氏陰性菌，呈紅色短桿菌，符合大腸桿菌的革蘭氏染色特征。經(jīng)PCR 擴增測序后，擴增出的片段長度在250～500 bp 之間的單一條帶，序列在NCBI 基因庫上經(jīng)過同源性比對顯示ECGD2010-1 和ECGD2010-2 與大腸桿菌的同源性為99.0%和98.9%，確定所分離出的菌株均為雞源性大腸桿菌。

4 結論

本試驗結果表明，分離自廣東博羅地區(qū)某養(yǎng)雞場和梅州地區(qū)某養(yǎng)雞場的菌株為雞源大腸桿菌，命名為ECGD2010-1 株 和ECGD2010-2 株。ECGD2010-1 對 慶大霉素和丁胺卡那霉素敏感；ECGD2010-2株除對氨芐西林耐藥外，對其他抗生素均表現(xiàn)出高度敏感。