高燕，奉樹成

(上海植物園 上海城市植物資源開發(fā)應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，上海 200231)

紫萼(Hostaventricosa)是百合科玉簪屬植物，為我國(guó)原產(chǎn)玉簪屬4個(gè)品種之一[1]。紫萼葉叢生有光澤，卵形至卵圓形?；ㄝ愀?0～100 cm，花紫色，花期6—7月，觀賞期長(zhǎng)，耐寒、耐旱，對(duì)土壤要求不高，適應(yīng)性強(qiáng)，管理粗放，是一種優(yōu)異的耐陰宿根草本。園林中常用于林下地被，或與周邊建筑山石搭配成景，也可用于盆栽、切花、切葉等[2-5]。除了園林觀賞應(yīng)用價(jià)值外，紫萼還具有藥用價(jià)值，紫萼的嫩葉和嫩芽可食用。因此，紫萼極具開發(fā)價(jià)值。由于紫萼玉簪野生種較少，童齡期長(zhǎng)，從播種到開花需3年以上時(shí)間[3]。紫萼是玉簪屬中唯一的天然4倍體，存在不完全無配生殖現(xiàn)象，母本不能產(chǎn)生雜種后代，種子不育[6]。研究紫萼的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，可以保證紫萼性狀的穩(wěn)定性，也為紫萼的推廣提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2018—2020年在上海植物園實(shí)施，材料取自上海植物園玉簪資源圃。試驗(yàn)以紫萼幼嫩花序部分為材料。取材后，將材料截取為2～4 cm的小段待用。

1.2 方法

取紫萼幼嫩花序部位，用洗潔精浸泡30 min，流水沖洗30 min。前期準(zhǔn)備75%酒精和2%次氯酸鈉溶液，滅菌ddH2O、三角瓶、鑷子、手術(shù)刀和濾紙待用。

1.2.1 滅菌

試驗(yàn)工作均在滅菌后的超凈工作臺(tái)上實(shí)施。外植體放置于無菌三角瓶中，先用無菌水震蕩清洗1次，再用75%酒精震蕩清洗30 s，無菌水沖洗2次。隨后用2%次氯酸鈉溶液消毒外植體，消毒時(shí)間設(shè)置情況如表1所示。外植體消毒后用無菌水沖洗5次，再用濾紙吸干水分后接種于培養(yǎng)基上。根據(jù)污染情況和芽的誘導(dǎo)情況選擇最佳滅菌方法。

1.2.2 誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置激素梯度。激素采用6-BA和NAA兩種激素組合促進(jìn)不定芽誘導(dǎo)，激素組合方式如表2所示。根據(jù)誘導(dǎo)狀態(tài)和誘導(dǎo)率決定最佳誘導(dǎo)方法。

1.2.3 增殖

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA、生長(zhǎng)素2,4-D和NAA，組合情況如表3所示，形成增殖培養(yǎng)基。經(jīng)過25 d的生長(zhǎng)，比較生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖率，確定最佳增殖培養(yǎng)基。

1.2.4 生根

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基添加不同激素，激素采用IBA和ABT兩種，濃度情況如表4所示。經(jīng)過30 d生根培養(yǎng)，對(duì)比根的發(fā)育狀態(tài)、生根率、根長(zhǎng)等情況，確定最佳生根培養(yǎng)基。

1.2.5 煉苗

室溫下打開瓶蓋放置3 d后，用流水清洗組培苗附著的培養(yǎng)基，整理根并種植于營(yíng)養(yǎng)缽中，觀察苗的生長(zhǎng)狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅菌

本試驗(yàn)采用2%次氯酸鈉溶液進(jìn)行滅菌，滅菌時(shí)間如表1所示，分別為7、14和21 min，對(duì)應(yīng)的污染率和出芽率呈現(xiàn)不同的變化。從污染率看出A1污染率較高，A2和A3之間沒有顯著差異，相比較A2可以達(dá)到比較好的滅菌效果。從出芽率看，A2出芽率最高為44.4%，與其他2組有顯著差異。綜合考慮，以2%次氯酸鈉溶液滅菌14 min為最優(yōu)的紫萼滅菌時(shí)間。

表1 不同滅菌時(shí)間對(duì)紫萼污染率和出芽率的影響

2.2 誘導(dǎo)

以MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA，細(xì)胞分裂素6-BA濃度在2～6 mg·L-1，生長(zhǎng)素NAA濃度在0～0.5 mg·L-1，如表2所示。6-BA為2 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率較低，且芽生長(zhǎng)停滯或緩慢；6-BA為4 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率相比較有增長(zhǎng)，其中NAA為0.2 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最高為46.3%，誘導(dǎo)出芽生長(zhǎng)迅速，芽生長(zhǎng)正常，展葉健康；6-BA濃度再增加后，起始材料與培養(yǎng)基接觸部位開始出現(xiàn)綠色愈傷，極個(gè)別芽小而畸形，誘導(dǎo)率也隨之下降。因此，最優(yōu)誘導(dǎo)配方為B5。

表2 不同激素含量對(duì)紫萼誘導(dǎo)的影響

2.3 增殖

誘導(dǎo)30 d后，將誘導(dǎo)出的健康芽轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基采用MS培養(yǎng)基添加6-BA 0.5～4 mg·L-1，生長(zhǎng)素NAA 0～0.5 mg·L-1，2,4-D 0～0.5 mg·L-1。采用L9(34)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 不同激素含量對(duì)紫萼芽增殖的影響

從伸長(zhǎng)倍率來看，C4和C9的伸長(zhǎng)倍率值最高，均為3.5，沒有顯著差異。從增殖倍率考慮，C6增殖倍率最高為6.0，其次為C9，增殖倍率為3.9。結(jié)合生長(zhǎng)狀況觀察，C4植株生長(zhǎng)正常，葉片寬大，無畸形，但增殖速度很慢。C6增殖速度快，但植株幾乎不伸長(zhǎng)，葉片細(xì)弱，展葉不明顯，部分基部開始出現(xiàn)玻璃化情況。C9葉片增殖速度較快，伸長(zhǎng)倍速較高，生長(zhǎng)正常，葉片寬大，無畸形(圖1)。因此，C9為增殖最優(yōu)培養(yǎng)基。

圖1 C9培養(yǎng)基上增殖22 d情況

2.4 生根

將健康植株從增殖培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)以1/2 MS為基本培養(yǎng)基添加ABT或IBA，觀察生根情況(圖2)。

圖2 D6培養(yǎng)基上生根20 d情況

生根情況如表4所示，添加IBA或ABT均可誘導(dǎo)生根，但生根率有較大差異。與ABT相比較，ABT生根率明顯低，且根粗短，葉片略黃，相比而言ABT更適合紫萼生根。ABT濃度為0.5 mg·L-1時(shí)紫萼狀態(tài)為佳，經(jīng)過30 d的培養(yǎng)，葉片濃綠，生根數(shù)量4～6根，長(zhǎng)度2～9 cm，根粗壯，整體植株形態(tài)正常。

表4 不同激素含量對(duì)紫萼生根的影響

2.5 煉苗

組培苗經(jīng)過1個(gè)月的生根培養(yǎng)形成健壯根后，可進(jìn)行煉苗(圖3)。穴盤中裝入適量基質(zhì)，基質(zhì)采用園土∶泥炭∶珍珠巖為1∶3∶1(體積比)。

圖3 紫萼煉苗20 d生長(zhǎng)情況

打開瓶蓋，將紫萼放在培養(yǎng)間3 d，取出后用流水沖洗干凈培養(yǎng)基，種植于基質(zhì)中，用多菌靈澆透，放置于大棚，溫度20～30 ℃，濕度85%左右。每15 d左右用多菌靈澆透一次。生長(zhǎng)2個(gè)月，成活率可達(dá)到97%以上。

2.6 育苗技術(shù)培養(yǎng)

紫萼作為典型的陰生植物，要求土壤排水良好，土層深厚。種植地點(diǎn)宜選擇涼爽通風(fēng)的陰濕環(huán)境，例如樹下、建筑物背陰處[4]。紫萼經(jīng)過2個(gè)月的煉苗，形成根系優(yōu)良、展葉完全的完整植株后，可移入林下或背陰處排水良好的土壤中露地種植。挖穴深度4～10 cm，保證根不外露、深不埋心，覆土與地面平齊即可，栽植后澆透水使土壤與根系充分接觸。地栽時(shí)可按薄肥勤施的原則添加有機(jī)肥或者少量磷肥，促進(jìn)生長(zhǎng)。

3 小結(jié)與討論

1976年已經(jīng)有關(guān)于玉簪屬種和品種的離體培養(yǎng)研究。至今對(duì)不同的玉簪屬種和品種分別從外植體、再生方式等方面進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究，外植體包括莖尖、花序、花器、花序切片、花瓣、子房、花葶組織等，再生方式包括不定苗、多芽苗等[7-9]。李玲等[1]以野生紫萼玉簪葉片為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽形成完整植株。蔣素華等[4]以紫萼幼苗為外植體，通過愈傷組織誘導(dǎo)不定芽建立再生體系。陳必勝等[10]以玉簪基部幼芽為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)冬芽?jī)?yōu)于春芽。Lubomski[11]的研究成果表明，再生能力最強(qiáng)的是莖尖、花蕾和葉柄較低部位。本試驗(yàn)取紫萼幼嫩花序?yàn)槠鹗疾牧稀?/p>

植物組織培養(yǎng)中使用較多的滅菌消毒劑包括乙醇、升汞、次氯酸鈉等溶液，有時(shí)候適量添加吐溫增加滲透性提高滅菌效率[12]。本試驗(yàn)采用75%乙醇滅菌30 s和2%次氯酸鈉溶液滅菌14 min相結(jié)合的方法，污染率降為2.73%，出芽率為44.44%。次氯酸鈉溶液滅菌時(shí)間再延長(zhǎng)后，出芽率大幅度降低，可能對(duì)外植體產(chǎn)生毒害作用從而導(dǎo)致誘導(dǎo)率下降。滅菌后多次用滅菌水對(duì)外植體反復(fù)漂洗，可以減少殘留次氯酸鈉溶液對(duì)外植體的傷害。

MS是植物組織培養(yǎng)中最常用的基本培養(yǎng)基之一，玉簪的組織培養(yǎng)方法中最常用的即MS培養(yǎng)基，MS培養(yǎng)基中的大量元素和微量元素提供了植物生長(zhǎng)所必需的無機(jī)鹽，有機(jī)元素和蔗糖提供植物生長(zhǎng)所需的碳源、氮源、礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和維生素，對(duì)植物細(xì)胞和組織增殖和分化起促進(jìn)作用。本試驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，可誘導(dǎo)、增殖并生根，形成完整植株。

激素在植物組織培養(yǎng)中起到至關(guān)重要的作用，在不同的步驟以基本培養(yǎng)基添加不同激素可達(dá)到培養(yǎng)目的。紫萼誘導(dǎo)過程中，添加6-BA 4 mg·L-1和NAA 0.2 mg·L-1可以達(dá)到較好的誘導(dǎo)效果，誘導(dǎo)率為46.3%，芽發(fā)育正常，沒有畸形或玻璃化等現(xiàn)象，且能夠在后期持續(xù)發(fā)育和分化。在獲得健康的不定芽后，通過MS基本培養(yǎng)基添加6-BA 4 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1和2,4-D 0.25 mg·L-1激素共同作用，可以達(dá)到較好的增殖效果，在該激素配比下，紫萼伸長(zhǎng)率為3.5，增殖率為3.9，芽體保持正常發(fā)育，未出現(xiàn)畸形或玻璃化等現(xiàn)象，并在隨后的1年多的繼代周期保持高速的增殖效率，為較適合的增殖培養(yǎng)基。生根培養(yǎng)中，以1/2 MS為基本培養(yǎng)基添加ABT更有利于生根和植株生長(zhǎng)，平均每株形成4～6根，根長(zhǎng)2～9 cm，生根率可達(dá)到98.0%，是適合紫萼生根的培養(yǎng)基。

紫萼經(jīng)過1個(gè)月的生根培養(yǎng)后形成完整植株，可以用于煉苗。在適合的溫度和濕度條件下，基質(zhì)采用園土、泥炭和珍珠巖混合，成活率在97%以上。園土黏重，添加泥炭后，增加土壤通氣性，改善酸堿度，提高土壤肥力。添加珍珠巖可以增加土壤透氣性，改善土壤保水能力和通氣條件[13]，減少土壤板結(jié)，降低紫萼在生長(zhǎng)過程中出現(xiàn)爛根現(xiàn)象。珍珠巖有利于移栽成活，但不利于后期葉片和根系生長(zhǎng)，泥炭促進(jìn)移栽成活和葉片生長(zhǎng)，園土不利于初期生根和葉片生長(zhǎng)，但有利于后期植物生長(zhǎng)[14]。因此，采用3種基質(zhì)的混合可促進(jìn)移栽成活和后期生長(zhǎng)。培養(yǎng)2個(gè)月后，可移栽至陰涼的地方露地栽培。在玉簪生長(zhǎng)過程中可以施加葉面肥促進(jìn)葉片生長(zhǎng)，也可以在露地栽植前添加基肥，一般是腐熟有機(jī)肥6～7 kg·m-2。生長(zhǎng)過程中以薄肥勤施、少量多次、營(yíng)養(yǎng)齊全為原則[15]。