夏方山， 王聰聰， 李紅玉， 劉 曼， 鄭 川， 張耀丹， 范華芳

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 山西 太谷 030801)

硒是人類和動物體內(nèi)維持免疫及內(nèi)分泌等功能必需的微量元素[1]，其缺乏會導(dǎo)致人類患克山病、大骨節(jié)病及癲癇等多種疾病[2]。土壤有效硒水平?jīng)Q定了植物體內(nèi)的硒含量高低，從而決定了人類攝入的硒水平[3]。硒的有效性在世界上大多數(shù)土壤中都處于較低水平，從而導(dǎo)致人體硒缺乏成為一個(gè)全球性公共衛(wèi)生問題[2,4]，目前全世界有15%～20%的兒童和成年人患有硒缺乏癥[5]。因此，如何妥善解決這一問題成為人類當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。通過生物富硒適當(dāng)?shù)匮a(bǔ)充硒不僅能有效提高植物產(chǎn)量和品質(zhì)，還可增加人體內(nèi)的硒水平[6-7]。然而，人體硒攝入量的安全范圍非常窄，攝入過多會導(dǎo)致人體產(chǎn)生硒毒害及生態(tài)環(huán)境問題，因而在富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中要謹(jǐn)慎控制硒濃度[8-10]。種子引發(fā)是一種微量元素施用中經(jīng)濟(jì)有效且備受關(guān)注的簡單生理策略[11-12]，被廣泛采用于許多植物的富硒生產(chǎn)[2]。硒對高等植物的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用[4]，硒引發(fā)可以提高植物的種子發(fā)芽率、幼苗質(zhì)量、光合作用及抗氧化能力等，從而提高植物的生長發(fā)育能力和抗逆性[13]。因此，種子引發(fā)已成為富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的基本生物強(qiáng)化策略。

紫花苜蓿(Medicagosativa)具有適應(yīng)性強(qiáng)、再生快、產(chǎn)量高、富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)等優(yōu)良特性，是當(dāng)下世界各地廣泛種植的優(yōu)良飼草和綠肥作物[14-15]。硒作為動物生長發(fā)育所必需的微量元素，既可預(yù)防其某些疾病的發(fā)生，又對維持其正常生長發(fā)育及生產(chǎn)具有極其重要的作用[16]。然而，傳統(tǒng)的動物生產(chǎn)中直接添加硒往往會出現(xiàn)高毒性、不均勻攝入及低生物利用率等不良現(xiàn)象[17]。因此，富硒紫花苜蓿的生產(chǎn)也越來越收到重視，目前已采用土壤施肥、硒菌接種及葉面噴施等多種形式進(jìn)行[6,18]，并發(fā)現(xiàn)土壤施硒肥能夠提高紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力，從而促進(jìn)紫花苜蓿的生長[17]。硒引發(fā)影響紫花苜蓿生長的報(bào)道仍然較少，且硒引發(fā)對其種子抗氧化能力的影響尚不清楚。因此，如何利用引發(fā)技術(shù)進(jìn)行富硒紫花苜蓿生產(chǎn)尚不成熟。本研究旨在評價(jià)硒濃度和引發(fā)時(shí)間對紫花苜蓿種子抗氧化能力的影響，以期為富硒紫花苜蓿生產(chǎn)提供一種經(jīng)濟(jì)有效的基本策略。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿品種為‘偏關(guān)苜?！浞N子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，2018年秋季收獲于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技實(shí)驗(yàn)站，于—20℃下密封保存至2019年8月試驗(yàn)進(jìn)行。

1.2 引發(fā)處理

將均勻飽滿的紫花苜蓿種子浸入濃度為0，0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 mmol·L-1的亞硒酸鈉溶液中，在20℃分別處理0，3，6，9和12 h后，用蒸餾水沖洗3次，并用濾紙吸干其表面水分后，25℃和空氣相對濕度為45%的黑暗環(huán)境中自然風(fēng)干3 d，至含水量鮮重基礎(chǔ)上約為10%，于4℃下密封保存?zhèn)溆?。每個(gè)處理重復(fù)4次。

1.3 發(fā)芽試驗(yàn)及發(fā)芽率測定

按照國際種子檢驗(yàn)協(xié)會的種子檢驗(yàn)規(guī)程(2017)[19]進(jìn)行，具體操作步驟見Xia等[20]方法。

1.4 生理指標(biāo)測定

粗酶液的提取參照Kibiza等[21]的方法進(jìn)行，將上清液在4℃下保存?zhèn)溆?。超氧化物歧化?superoxide dismutase，SOD)活性參照Rao和Sresty[22]的方法測定，抗壞血酸過氧化物酶(aseorbate peroxidase，APX)活性參照Nakano和Asada[23]的方法測定，過氧化氫酶(catalase，CAT)活性參照Aebi[24]的方法測定，過氧化物酶(peroxidase，POD)活性參照Chance和Maehly[25]的方法測定，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量參照Bailly等[26]的方法測定，可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定，所用試劑盒購于南京建成科技有限公司。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對紫花苜蓿種子酶活性指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，用Duncans法進(jìn)行多重比較(P<0.05)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子發(fā)芽率的影響

相同引發(fā)時(shí)間下，紫花苜蓿種子發(fā)芽率隨硒濃度的增加呈先升高后下降的趨勢(表1)。硒濃度為0和0.5 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子發(fā)芽率隨引發(fā)時(shí)間延長而升高；硒濃度為1.0和2.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子發(fā)芽率隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升高后下降的趨勢；硒濃度為4.0和8.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子發(fā)芽率隨引發(fā)時(shí)間延長而降低。紫花苜蓿種子發(fā)芽率在硒濃度為0和0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h達(dá)到最大值；硒濃度為8.0 mmol·L-1引發(fā)6～12 h時(shí)顯著低于其他處理(P<0.05)。

2.2 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子SOD活性的影響

相同引發(fā)時(shí)間下，紫花苜蓿種子SOD活性隨硒濃度的增加呈先升高后下降的趨勢(表2)。硒濃度為0和0.5 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子SOD活性隨引發(fā)時(shí)間延長而升高；硒濃度為1.0～8.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子SOD活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升高后下降的趨勢。紫花苜蓿種子SOD活性在硒濃度為0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最高，顯著高于其他處理(P<0.05)；硒濃度為8.0 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最低，顯著低于其他處理(P<0.05)。

2.3 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子CAT活性的影響

相同引發(fā)時(shí)間下，紫花苜蓿種子CAT活性隨硒濃度的增加呈先升高后下降的趨勢(表3)。硒濃度為0和0.5 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子CAT活性隨引發(fā)時(shí)間延長而升高；硒濃度為1.0和2.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子CAT活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升高后下降的趨勢；硒濃度為4.0和8.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子CAT活性隨引發(fā)時(shí)間延長而顯著降低(P<0.05)。紫花苜蓿種子CAT活性在硒濃度為1.0 mmol·L-1引發(fā)9 h時(shí)最高，顯著高于其他處理(P<0.05)；硒濃度為4.0和8.0 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)顯著低于其他處理(P<0.05)。

表1 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effect of selenium priming on germination percentage of alfalfa seeds/%

表2 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子SOD活性的影響Table 2 Effect of selenium priming on SOD activity of alfalfa seeds/U·mg-1 protein

表3 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子CAT活性的影響Table 3 Effect of selenium priming on CAT activity of alfalfa seeds/U·min-1·mg-1 protein

2.4 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子APX活性的影響

相同引發(fā)時(shí)間下，紫花苜蓿種子APX活性隨硒濃度的增加呈先升高后下降的趨勢(表4)。硒濃度為0和0.5 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子APX活性隨引發(fā)時(shí)間延長而升高；硒濃度為1.0～4.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子APX活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升高后下降的趨勢；硒濃度為8.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子APX活性隨引發(fā)時(shí)間延長而顯著降低(P<0.05)。紫花苜蓿種子APX活性在硒濃度為1.0 mmol·L-1引發(fā)9 h時(shí)最高，顯著高于其他處理(P<0.05)；硒濃度為8.0 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最低，顯著低于其他處理(P<0.05)。

表4 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子APX活性的影響Table 4 Effect of selenium priming on APX activity of alfalfa seeds/μmol·min-1·mg-1 protein

2.5 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子POD活性的影響

相同引發(fā)時(shí)間下，紫花苜蓿種子POD活性隨硒濃度的增加呈先升高后下降的趨勢(表5)。硒濃度為0和0.5 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子POD活性隨引發(fā)時(shí)間延長而升高；硒濃度為1.0～8.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子POD活性隨引發(fā)時(shí)間延長呈先升高后下降的趨勢。紫花苜蓿種子POD活性在硒濃度為0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最高，顯著高于其他處理(P<0.05)；硒濃度為8.0 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最低，顯著低于其他處理(P<0.05)。

表5 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子POD活性的影響Table 5 Effect of selenium priming on POD activity of alfalfa seeds/U·min-1·mg-1 protein

2.6 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子MDA含量的影響

引發(fā)3 h時(shí)，紫花苜蓿種子MDA含量隨硒濃度的增加而升高；引發(fā)6～12 h時(shí)，紫花苜蓿種子MDA含量隨硒濃度的增加呈先下降后升高的趨勢(表6)。硒濃度為0和0.5 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子MDA含量隨引發(fā)時(shí)間延長而降低；硒濃度為1.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子MDA含量隨引發(fā)時(shí)間延長呈先下降后升高的趨勢；硒濃度為2.0～8.0 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿種子MDA含量隨引發(fā)時(shí)間延長而顯著升高(P<0.05)。紫花苜蓿種子MDA含量在硒濃度為0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最低；硒濃度為8.0 mmol·L-1引發(fā)9 h和12 h時(shí)顯著高于其他處理(P<0.05)。

表6 硒引發(fā)對紫花苜蓿種子MDA含量的影響Table 6 Effect of selenium priming on MDA content of alfalfa seeds/μmol·Fw-1·mg-1 protein

3 討論

種子引發(fā)已被廣泛用于促進(jìn)植物種子萌發(fā)及提高其幼苗建成的一致性[27]。硒能夠提高植物種子的發(fā)芽率及其幼苗質(zhì)量[2]。紫花苜蓿種子萌發(fā)能力高低與其引發(fā)時(shí)間及所用溶液的濃度密切相關(guān)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度硒引發(fā)能促進(jìn)水稻(Oryzasativa)種子的萌發(fā)及幼苗生長，而高濃度硒引發(fā)則相反[2]。本試驗(yàn)中，低濃度(0.5和1.0 mmol·L-1)硒引發(fā)能夠提高紫花苜蓿種子的發(fā)芽率，且需要較長時(shí)間的引發(fā)才會有效促進(jìn)萌發(fā)，在0和0.5 mmol·L-1的硒濃度引發(fā)12 h時(shí)最高；而高濃度則會降低其發(fā)芽率，且經(jīng)短時(shí)間的引發(fā)就會出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，這說明低強(qiáng)度的硒引發(fā)能夠提高紫花苜蓿的種子活力水平，而高強(qiáng)度的硒引發(fā)則會降低其種子活力水平，這與前人對土壤中施用硒肥影響紫花苜蓿生長的研究結(jié)論相符[17,28]。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中通過種子引發(fā)方式進(jìn)行富硒紫花苜蓿生產(chǎn)時(shí)必須謹(jǐn)慎控制其處理強(qiáng)度。

硒是參與抗氧化反應(yīng)等細(xì)胞代謝的重要微量元素[28]，適量的硒對植物幼苗生長的促進(jìn)作用也與其抗氧化能力的增強(qiáng)具有密切關(guān)系[29]。然而，硒往往表現(xiàn)出相對較窄的生理活性范圍，其過量和缺乏都會對機(jī)體功能產(chǎn)生負(fù)面影響[2,17,28]。本研究中，相同引發(fā)時(shí)間的紫花苜蓿種子SOD,CAT,APX及POD活性隨硒濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，這說明低濃度硒引發(fā)能夠提高紫花苜蓿種子的抗氧化能力，從而可能利于打破其硬實(shí)，但高濃度硒引發(fā)則會降低其抗氧化能力。這與水稻種子的硒引發(fā)研究發(fā)現(xiàn)相似[2]，而且與土壤中施用硒肥對紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影響規(guī)律也相似[17]。適量外源硒能夠增加植物抗氧化酶的數(shù)量和活性，從而提高其活性氧的清除能力，能夠更好地促進(jìn)其生長發(fā)育[30]。低濃度硒引發(fā)對紫花苜蓿種子SOD活性的提高可能與硒增強(qiáng)了其介導(dǎo)的SOD酶轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)[31]，而其CAT,APX及POD活性的升高則可能是其SOD活性增強(qiáng)產(chǎn)生了大量H2O2造成的[17]。然而，高濃度硒引發(fā)降低了其SOD,CAT,APX及POD活性一方面可能由于過量積累H2O2引起了脂質(zhì)過氧化損傷所致[2,17]，另一方面可能與硒在轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物的過程中取代了硫類似物而非特異性地結(jié)合到蛋白質(zhì)中，進(jìn)而造成其抗氧化系統(tǒng)的損傷有關(guān)[32]。類似地，低濃度硒引發(fā)時(shí)紫花苜蓿種子SOD,CAT,APX及POD活性隨引發(fā)時(shí)間延長而升高，而高濃度硒引發(fā)時(shí)間較長時(shí)會降低紫花苜蓿種子的SOD,CAT,APX及POD活性，這說明低濃度硒引發(fā)能夠提高紫花苜蓿種子的抗氧化能力，而高濃度硒引發(fā)較長時(shí)間時(shí)則會降低其抗氧化能力。本試驗(yàn)中，硒濃度為0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)抗氧化能力最強(qiáng)，而硒濃度為8.0 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)抗氧化能力最弱。

植物體內(nèi)抗氧化能力高低會直接決定其活性氧積累的多少，而活性氧的過量積累又會引起脂質(zhì)過氧化作用，從而導(dǎo)致其標(biāo)志性產(chǎn)物MDA含量升高[17]。本試驗(yàn)中，低濃度硒引發(fā)降低了紫花苜蓿種子的MDA含量，說明低濃度硒引發(fā)降低了紫花苜蓿種子細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用，從而有利于其萌發(fā)。前人研究發(fā)現(xiàn)，低濃度硒引發(fā)能夠降低水稻種子的MDA含量，從而促進(jìn)其種子萌發(fā)和幼苗生長[2]，而土壤中施入低劑量的硒肥會降低紫花苜蓿幼苗中MDA含量[17]。這可能既與其抗氧化能增強(qiáng)有關(guān)，又與硒酸鹽本身具有抗氧化能力有關(guān)[2,17]。然而，高濃度硒引發(fā)時(shí)紫花苜蓿種子的SOD,CAT,APX及POD活性降低，因而其MDA含量升高，這說明高濃度硒引發(fā)增強(qiáng)了紫花苜蓿種子的脂質(zhì)過氧化損傷，從而抑制了其種子萌發(fā)。因此，紫花苜蓿種子MDA含量在硒濃度為0.5 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最低，而在硒濃度為8.0 mmol·L-1引發(fā)12 h時(shí)最高。

4 結(jié)論

硒引發(fā)對紫花苜蓿種子發(fā)芽率及其抗氧化能力的影響與其濃度和引發(fā)時(shí)間有密切關(guān)系。低濃度硒引發(fā)(0.5和1.0 mmol·L-1)會提高紫花苜蓿種子的發(fā)芽率，增強(qiáng)其SOD,CAT,APX及POD活性，進(jìn)而抑制了其脂質(zhì)過氧化作用的發(fā)生，表現(xiàn)為其MDA含量降低，而高濃度硒引發(fā)則相反。本試驗(yàn)中，濃度為0.5 mmol·L-1的硒引發(fā)12 h可能是富硒紫花苜蓿生產(chǎn)的最佳處理。